Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

Summary

Unter Verwendung menschlicher primärer Prostataepithelzellen berichten wir über eine neuartige biomarkerfreie Methode der funktionellen Charakterisierung von stammähnlichen Zellen durch einen sphäroidbasierten Labelretentionstest. Für die Beschriftung von BrdU-, CFSE- oder Far Red 2D-Zellen wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll beschrieben. dreidimensionale Sphäroidbildung; kennzeichnungserhaltende stammähnliche Zellidentifikation durch Immunzytochemie; isolierung durch FACS.

Abstract

Trotz der Fortschritte in der adulten Stammzellforschung bleibt die Identifizierung und Isolierung von Stammzellen aus Gewebeproben eine große Herausforderung. Während ansässige Stammzellen mit Nischenbeschränkungen in erwachsenen Geweben relativ still sind, treten sie in einer ankerfreien dreidimensionalen (3D) Kultur in den Zellzyklus ein und durchlaufen sowohl eine symmetrische als auch eine asymmetrische Zellteilung, was sowohl Stamm als auch Vorläufer Zellen. Letztere vermehren sich schnell und sind die Hauptzellpopulation in verschiedenen Stadien der Abstammungsbindung, die heterogene Sphäroide bilden. Unter Verwendung der primären normalen menschlichen Prostataepithelzellen (HPrEC) wurde ein sphäroidbasierter, etikettenretentionsbezogener Assay entwickelt, der die Identifizierung und funktionelle Isolierung der sphäroid-initiierenden Stammzellen bei einer einzelzelligen Auflösung ermöglicht.

HPrEC oder Zelllinien werden mit BrdU für 10 Tage zweidimensional (2D) kultiviert, um ihre Aufnahme in die DNA aller teilenden Zellen, einschließlich selbsterneuernder Stammzellen, zu ermöglichen. Das Auswaschen beginnt mit der Übertragung in die 3D-Kultur für 5 Tage, in denen sich Stammzellen durch asymmetrische Teilung selbst erneuern und die Sphäroidbildung initiieren. Während relativ stille Tochterstammzellen BrdU-markierte Eltern-DNA behalten, vermehren sich die Tochtervorläufer schnell und verlieren das BrdU-Label. BrdU kann durch CFSE- oder Far Red Pro-Dyes ersetzt werden, die eine livee Stammzellisolierung durch FACS ermöglichen. Die Merkmale der Stammzellwerden werden durch in vitro sphäroide Bildung, In-vivo-Geweberegenerationstests und durch Dokumentation ihrer symmetrischen/asymmetrischen Zellteilungen bestätigt. Die isolierten, etikettenerhaltenden Stammzellen können durch nachgeschaltete molekulare und biologische Studien, einschließlich RNA-seq, ChIP-seq, Einzelzellerfassung, Metabolische Aktivität, Proteomprofilierung, Immunzytochemie, Organoidbildung und In-vivo-Geweberegeneration, streng abgefragt werden. Wichtig ist, dass dieser markerfreie funktionelle Stammzellisolationsansatz stammähnliche Zellen aus frischen Krebsproben und Krebszelllinien aus mehreren Organen identifiziert, was auf eine breite Anwendbarkeit hindeutet. Es kann verwendet werden, um Krebsstamm-ähnliche Zell-Biomarker zu identifizieren, Sieb-Arzneimittel, die auf Krebsstammzellen-ähnliche Zellen abzielen, und neue therapeutische Ziele bei Krebs zu entdecken.

Introduction

Die menschliche Prostata enthält luminale Epithel mit sekretorische Funktion und Basalzellen, die ihm zusammen mit einer ungewöhnlichen neuroendokrinen Zellkomponente zugrunde liegen. Die Epithelzellen werden in diesem Fall aus einer seltenen Population von Prostatastammzellen erzeugt, die in vivo relativ still sind und als Reparatursystem fungieren, um die Drüsenhomöostase im Laufe des Lebens aufrecht zu erhalten¹. Trotz vieler Fortschritte bleibt die Identifizierung und funktionelle Isolierung von Prostatastammzellen eine große Herausforderung auf dem Gebiet. Stammzell-Biomarker, einschließlich zelloberflächenmarkerbasierter Methoden in Kombination mit Durchflusszytometrie, werden häufig für die Stammzellforschung^2,3,4verwendet. Die Ergebnisse für die Anreicherung und Isolierung variieren jedoch stark als Funktion von Markerkombinationen und Antikörperspezifität^5,6, was Fragen über die Identität der isolierten Zellen aufwirft. Ein weiterer weit verbreiteter Ansatz zur stammartigen Zellanreicherung ist die dreidimensionale (3D) Sphäroidkultur^2,3,4. Während ansässige Stammzellen in vivo mit Nischenbeschränkungen relativ still sind, durchlaufen sie eine Zellteilung in der 3D-Matrixkultur (sowohl symmetrisch als auch asymmetrisch) und erzeugen sowohl Stamm- als auch Vorläuferzellen, die sich schnell zur Abstammungsverpflichtung^7,8vermehren. Die gebildeten Sphäroide sind eine heterogene Mischung, die sowohl Stammzellen als auch Vorläuferzellen in verschiedenen Stadien der Abstammungsverpflichtung enthält, einschließlich Früh- und Spätstadium-Vorläuferzellen. So sind Assays mit den gesamten Sphäroiden nicht stammzellexklusiv, was die Identifizierung einzigartiger Stammzelleigenschaften unschlüssig macht. Daher ist es wichtig, Assays zu erstellen, um Prostatastammzellen zu identifizieren und von ihren Tochtervorläufern zu trennen. Zu diesem Zweck besteht das Ziel des aktuellen Protokolls darin, ein Assay-System zu etablieren, das eine effiziente Identifizierung und Isolierung von Stammzellen aus menschlichen Prostatageweben ermöglicht, gefolgt von einer robusten nachgelagerten Analyse ihrer biologischen Funktionen.

Langfristige 5-Brom-2′-Deoxyuridin (BrdU) Etikettenretention ist weit verbreitet für in vivo und In-vitro-Lineage-Tracing von Stammzellen auf der Grundlage ihrer verlängerten Verdoppelungszeit^9,10. Der aktuelle Ansatz zur Identifizierung und Isolierung von Prostatastammzellen basiert auf ihren relativen Ruhecharakteristik- und Beschriftungsretentionseigenschaften innerhalb einer gemischten Epithelpopulation. Darüber hinaus können auf der Grundlage der unsterblichen Strang-DNA-Hypothese nur Stammzellen asymmetrische Zellteilung durchlaufen. Die Stammzelle stellt die Tochterzelle dar, die die ältere elterliche DNA enthält, während die Vorläuferzelle, die eine engagierte Tochterzelle ist, die neu synthetisierte DNA empfängt. Die oben beschriebene einzigartige Stammzelleigenschaft wird genutzt, um brdU-Kennzeichnung enthoben Stammzellen in Primärkulturen durchzuführen und dann ihr Etikett nach BrdU-Waschung nach dem Transfer in die 3D-ankerfreie Sphäroidkultur nachzuverfolgen. Während die Mehrheit der primären Prostataepithelzellen einen basalen und transitverstärkenden Phänotyp in der 2D-Kultur behält, gibt es auch eine seltene Population von multipotenten Stammzellen, die die epitheliale Homöostase auffüllen und aufrechterhalten, wie die Bildung von Sphäroiden oder vollständig differenzierten Organoiden mit entsprechenden Kulturmedien beim Transfer auf 3D-Systeme^3,12belegt. In unserem aktuellen Protokoll identifizieren wir durch die Verwendung von HPrEC Prostatasphäroiden oder prostasphärenbasierten BrdU-, CFSE- oder Far Red Retentionstests, gefolgt von fluoreszaktivierter Zellsortierung (FACS), etikettenhaltende Stammzellen in Sphäroiden auf einer Einzelzellebene¹³.

Wichtig ist, dass wir die Stammzelleigenschaften von etikettenerhaltenden Zellen in frühen Sphäroiden im Vergleich zu den Vorläuferzellen mit Lineage-Verpflichtung weiter bestätigt haben. Dazu gehören Stammzell asymmetrische Teilung, In-vitro-Sphäroid-Bildungsfähigkeit und In-vivo-Geweberegenerationsfähigkeit, erhöhte Autophagie-Aktivität, augmentierte Ribosome-Biogenese und verminderte metabolische Aktivität. Anschließend wurde die RNAseq-Analyse durchgeführt. Es wurden differenziell exprimierte Gene in etikettenerhaltenden Sphäroidzellen beobachtet, die als neuartige Biomarker für menschliche Prostatastammzellen dienen können. Dieser sphäroidbasierte Label-Retaining-Ansatz kann auf Krebsproben angewendet werden, um eine kleine Anzahl von krebsstammähnlichen Zellen zu identifizieren, wodurch translationale Möglichkeiten zur Verwaltung der therapeutischen resistenten Populationen¹³. Im Folgenden wird der prostasphärenbasierte Labelretentionstest am Beispiel menschlicher Primärprostataepithelzellen (HPrEC) vorgestellt.

Protocol

Alle Zellhandhabungs- und Medienpräparate sollten mit aseptischer Technik in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II (BSC) durchgeführt werden. 1. Kultur und Pflege von HPrEC-Zellen in 2D 100 mm Kulturgerichte mit 2 ml 2,5 g/cm2 Fibronectinlösung über Nacht bei Raumtemperatur (RT) beschichten. Die Lösung ansaugen und die Kulturgerichte im BSC 45 min lufttrocknen lassen. Fibronectin-beschichtete Kulturgerichte können 2–4 Wochen bei 4 °C gelagert werden….

Representative Results

Primäre normale menschliche Prostataepithelzellen werden in fibronectinbeschichtete Kulturgerichte gelegt und das Zellwachstum wird in der 2D-Kultur beibehalten (Abbildung 1a). Beim Transfer in die 3D-Kultur mit einer Kellermembranmatrix sterben differenzierte Epithelzellen langsam aus. Nur Prostatastammzellen können in einer ankerfreien Kultur überleben und in 5 Tagen Sphäroide bilden (Abbildung 1b). <p class="jove_cont…

Discussion

Die Durchflusszytometrie mit mehreren Stammzelloberflächenmarkern ist ein häufig verwendeter Ansatz für die Stammzellforschung, obwohl es an Spezifität und Selektivität^1,5,6fehlt. Während die Sphäroidbildung in einem 3D-Kultursystem eine weitere nützliche Methode zur Anreicherung der seltenen Stammzellpopulation aus primären Epithelzellen, einschließlich HPrEC, ist, sind die resultierenden Sphäroide immer noch eine he…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
1 mL tuberculin syringes	Bectin Dickinson	BD 309625
1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile
100 mm culture dishes	Corning/Falcon	353003
12-well culture plate	Corning/Falcon	353043
15 mL centrifuge tubes	Corning/Falcon	352097
22 x 22 mm coverslips, sq	Corning	284522	For MatTek 35 mm culture dish
24 x 50 mm coverslips	Corning	2975245
26G x 1.5 inch hypodermic needle	Monoject	1188826112
2N HCl
35 mm culture dish with cover glass bottom	MatTek Corp	P35G-0-10-C	Glass bottom No. 0, uncoated, irradiated
40 µm pore nylon cell strainer	Corning	352340
5% CO2 culture incubator, 37 °C	Forma
50 mL centrifuge tubes	Corning/Falcon	352098
5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap	Corning	352235	35 µm nylon mesh
6-well culture plates	Corning	353046
8-well chamber slides	Millipore Sigma	PEZGS0816
Aqueous mounting medium containing DAPI	Vector Laboratories	H-1200	A nuclear fluorescent dye
Biological safety cabinet, Level 2 certified
BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine)	Sigma-Aldrich	B5002	1 mM stock solution in DMSO
Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes	Eppendorf
Centrifuge for 15 mL tubes	Beckman Coulter		Allegra 6
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)	Thermo Fisher Scientific	C34554	5 mM stock solution in DMSO
cytochalasin D	Thermo Fisher Scientific	PHZ1063
Dispase 1U/mL	StemCell Technologies	07923
FACS CellSorter MoFlo XDP	Beckman Coulter	s
Far-Red pro-dye	Thermo Fisher	C34564	5 mM stock solution in DMSO
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	For coating 100 mm culture dishes
Fluorescent microscope with color digital camera	Carl Zeiss		Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-11029
HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)	Lifeline Cell Technology	FC-0038	Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen
ice bucket and ice
Inverted microsope with digital camera
Matrigel, low growth factor, phenol-red free	Corning	356239
Methanol	Corning	A452-4
Mouse anti-BrdU antibody	Cell Signaling	5292S
Mouse IgG antibody (negative control)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
Pipettors and tips, various sizes
PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)	Lifeline Cell Technology	LL-0041
Propidium Iodide (PI)	R & D Systems	5135/10	10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark
Serological pipets, various sizes
Software for sphere counting and size measurements
Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Water bath, 37 °C
z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope