Fabrication et mise en œuvre d'une plate-forme de microscopie de traction sans référence

Summary

Ce protocole fournit des instructions pour la mise en œuvre de la lithographie multiphoton pour fabriquer des tableaux tridimensionnels de marqueurs fiducial fluorescents intégrés dans des hydrogels à base de poly(éthylène glycol) pour une utilisation comme microscopie sans force de traction sans référence. Plates-formes. À l’aide de ces instructions, la mesure de la souche de matériau 3D et le calcul des tractions cellulaires sont simplifiés afin de promouvoir des mesures de la force de traction à haut débit.

Abstract

La quantification de la déformation des matériaux induits par les cellules fournit des informations utiles sur la façon dont les cellules détectent et réagissent aux propriétés physiques de leur microenvironnement. Bien qu’il existe de nombreuses approches pour mesurer la souche matérielle induite par les cellules, nous fournissons ici une méthodologie pour la surveillance de la souche avec une résolution sous-micron d’une manière sans référence. À l’aide d’un processus de modelage photolithographique à deux photons, nous démontrons comment générer des substrats synthétiques réglables mécaniquement et bioactivement contenant des rangées intégrées de marqueurs fiducial fluorescents pour mesurer facilement les trois dimensions ( 3D) profils de déformation des matériaux en réponse aux tractions de surface. À l’aide de ces substrats, les profils de tension cellulaire peuvent être cartographiés à l’aide d’une seule pile d’images 3D d’une cellule d’intérêt. Notre objectif avec cette méthodologie est de faire de la microscopie de force de traction un outil plus accessible et plus facile à mettre en œuvre pour les chercheurs qui étudient les processus de mécanotransduction cellulaire, en particulier les nouveaux arrivants sur le terrain.

Introduction

La microscopie de force de traction (TFM) est le processus d’approximation des tractions cellulaires à l’aide de champs de déplacement interpolés de marqueurs fiducial générés par une cellule adhérente et contractile. En utilisant TFM, l’influence des indices mécaniques dans l’environnement extracellulaire sur les processus cellulaires importants tels que la prolifération, la différenciation et la migration peut être étudiée^1,2,3^{,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12}. Malheureusement, de nombreuses approches existantes peuvent être difficiles à mettre en œuvre ou exiger une connaissance des outils d’analyse et de calcul hautement spécialisés qui rendent l’ondes de POINTE difficile à utiliser pour les chercheurs inexpérimentés. Nous décrivons une méthodologie pour générer une plate-forme TFM qui élimine une partie de la difficulté d’analyse tout en fournissant également l’acquisition de données à haut débit.

Parmi les approches TFM existantes, la plus couramment utilisée pour quantifier la souche matérielle consiste à incorporation de petits marqueurs fluorescents (généralement des perles fluorescentes de la taille d’un nanomètre ou d’un micromètre) dans un hydrogel déformable, comme le polyacrylamide (PAA) ou le poly (éthylène glycol) diacrylate (PEGDA)^13,14,15. Ces approches à base de perles permettent de regrouper densément les marqueurs fiduciaux autour d’une cellule d’intérêt afin de maximiser l’échantillonnage par déplacement. Malheureusement, la distribution des perles dans l’hydrogel ne peut pas être directement contrôlée de sorte que l’organisation spatiale est aléatoire. Ce placement aléatoire conduit à des problèmes tels que les perles qui sont trop proches les uns des autres pour résoudre avec précision, ou si la propagation que les taches du substrat donnent des données de faible qualité. L’incapacité de prédire où se trouvent les marqueurs fiducial en l’absence de cellules crée également une contrainte que, pour chaque ensemble collecté de données de traction cellulaire, une image de référence supplémentaire des marqueurs sous-jacents dans un état détendu doit également être capturée. L’image de référence est nécessaire pour que le déplacement dans l’image stressée puisse être approximatif comme la différence entre les images stressées et non stressées. Pour atteindre un état détendu, les cellules mesurées sont soit chimiquement détendues, soit complètement enlevées. Ce processus empêche souvent l’acquisition d’autres mesures expérimentales, inhibe les études cellulaires à long terme et limite le débit. Une image de référence nécessite également des techniques d’enregistrement d’images pour tenir compte de la dérive qui peut avoir eu lieu pendant l’expérimentation, conduisant souvent à l’appariement manuel encombrant des images d’état de stress aux images de référence.

D’autres méthodes TFM jugées sans référence, mettent en œuvre une certaine forme de contrôle sur la distribution des marqueurs fiducial, soit par lithographie haute résolution, impression par microcontact, ou micromolding^{16,17,18 ,19,20}. Le TFM sans référence est réalisé en supposant que l’état détendu de chaque marqueur fiducial peut être prédit en fonction de la façon dont les positions de marqueur ont été prescrites pendant le processus de fabrication. Ces méthodes permettent de saisir complètement l’état de tension d’une cellule au sein d’une seule capture d’image dans laquelle les déplacements de marqueurs fiducial sont mesurés par rapport à une référence implicite que l’on peut déduire de la géométrie du marqueur fiducial. Bien que l’uniformité dans le placement des marqueurs soit généralement atteinte à l’aide de ces plates-formes, elles souffrent généralement de leurs propres lacunes par rapport aux approches largement utilisées basées sur les perles, y compris : 1) une diminution de la résolution de traction; 2) diminution de l’exactitude des déplacements hors avion (dans certains cas, une incapacité totale de mesurer); et 3) diminution de la personnalisation des substrats et des matériaux de plate-forme (p. ex., présentation de ligands, propriétés mécaniques).

Pour remédier à ces lacunes, nous avons conçu une nouvelle plate-forme TFM sans référence. La plate-forme utilise la chimie activée par multiphoton pour relier un petit volume d’un fluorophore dans des emplacements 3D spécifiques dans l’hydrogel qui servent de marqueurs fiducial pour mesurer la souche matérielle. De cette façon, nous avons conçu une plate-forme qui fonctionne de la même façon que les approches basées sur les perles, mais avec l’avantage significatif que les marqueurs fiducial sont organisés en tableaux quadrillés permettant le suivi sans référence des souches matérielles. Cette propriété sans référence offre de nombreux avantages. D’abord et avant tout, il permet une surveillance non intrusive des états de traction cellulaire (c.-à-d., contourne la nécessité de détendre ou d’enlever les cellules pour acquérir des positions de référence des marqueurs fiduciaux déplacés). C’était notre objectif principal dans la conception de ce système, car nous avions l’intention d’intégrer d’autres méthodes d’analyse en aval en tandem avec TFM, ce qui peut être difficile avec des approches destructrices de point final TFM. Deuxièmement, l’utilisation d’une référence implicite basée sur des tableaux quadrillés permet une automatisation quasi complète de l’analyse des déplacements. La régularité des tableaux crée un flux de travail prévisible où l’occurrence de cas exceptionnels (c.-à-d. des données de cellules d’échantillon contenant des artefacts imprévus tels que l’espacement sous-optimal des marqueurs ou les décalages d’enregistrement) peut être maintenue au minimum. Troisièmement, l’oubli de la nécessité d’acquérir une image de référence offre la liberté de surveiller de nombreuses cellules sur un seul échantillon sur de longues périodes de temps. Cela contraste avec les approches traditionnelles à base de perles, où, selon la fidélité des mouvements automatisés de stade du microscope, les erreurs de positionnement peuvent s’accumuler et augmenter la difficulté d’enregistrer correctement les images de référence à la tension cellulaire Images. Dans l’ensemble, cette plate-forme facilite un débit plus élevé dans la collecte de données sur les tensions cellulaires.

Avec ce protocole, nous espérons familiariser les lecteurs avec la technique de lithographie à balayage laser à deux photons que nous avons mise en œuvre pour générer cette plate-forme TFM sans référence pour mesurer les composants de traction en avion et hors plane générés par les cellules enseduites en surface. Non couvert dans ce protocole est la synthèse de certains des composants monomériques. En général, ces réactions comprennent des schémas de réaction de synthèse « un pot » presque identiques décrits précédemment²¹, et des alternatives à ces produits peuvent également être achetées. Nous visons également à familiariser les lecteurs avec les outils logiciels que nous avons générés pour promouvoir l’utilisation de microscopes à balayage laser disponibles dans le commerce comme outils d’impression 3D et pour faciliter l’analyse des déplacements de marqueurs fiducials.

Protocol

1. Photopolymérisation d’un hydrogel de base PEGDA Rassemblement de réactifs Recueillir le lithium phényl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), 3.4 kDa poly (éthylène) diacrylate de glycol (PEGDA), pyrrol n-vinyl (NVP), AlexaFluor 488 étiqueté PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 étiqueté PEGDA (PEG-633), et PEPtide RGDS PEGylated ( PEG-RGDS) de leurs congélateurs respectifs et amener chacun à la température ambiante. Dans les tubes de microcentrifuge ambre sépa…

Representative Results

Tout au long du protocole, il y a un certain nombre de points de contrôle qui fournissent des commentaires pour évaluer la qualité de la procédure de modelage. Afin de fournir un aperçu de la façon d’évaluer les progrès réalisés à chacun de ces points de contrôle, nous fournissons les résultats représentatifs d’une expérience réelle. Les résultats mettent en évidence l’application de ce protocole effectué sur un hydrogel photopatterned préparé pour l’analyse de TFM des cellules endothéliales ombilic…

Discussion

L’objectif de ce protocole est de fournir un flux de travail qui atténue une grande partie de la difficulté associée à la génération et à l’analyse des données TFM. Une fois préparés, les hydrogels photopatterned sont simples à utiliser, exigeant seulement la connaissance des pratiques standard de culture de tissu et de la microscopie de fluorescence. L’aspect sans référence permet une navigation insouciante sur les hydrogels chargés de cellules et élimine les étapes encombrantes de traitement d’image tel…

Materials

Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding	Pall	PN 4602	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips	in-house	in-house	Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome	Zeiss		Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil	3M		Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880	Zeiss		Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter	USCutter	SC631E	Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633	in-house	in-house	Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA	in-house	in-house	Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS	in-house	in-house	RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes	CELLTREAT	229638	8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097358-1004	For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp	UVP	Blak-Ray® B-100AP	Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.