Fabricação e implementação de uma plataforma de microscopia de força de tração sem referência

Summary

Este protocolo fornece instruções para implementar a litografia multifóton para fabricar matrizes tridimensionais de marcadores de referência fluorescente incorporados em hidrogéis de poli (etileno glicol) para uso como microscopia de força de tração, livre de referências Plataformas. Usando estas instruções, a medida da tensão material 3D e o cálculo de trações celulares são simplificados para promover medidas da força da tração da elevado-produção.

Abstract

Quantificar a deformação material induzida por células fornece informações úteis sobre como as células se sentem e respondem às propriedades físicas de seu microambiente. Embora existam muitas abordagens para medir a cepa material induzida por células, aqui fornecemos uma metodologia para monitorar a deformação com resolução de submícron de forma livre de referência. Usando um processo de padronização fotolitográfica ativado de dois fótons, demonstramos como gerar substratos sintéticos mecanicamente e bioativamente ajustáveis contendo matrizes incorporadas de marcadores de energia fluorescente para medir facilmente três dimensões ( 3D) perfis de deformação de material em resposta a tracções superficiais. Usando esses substratos, os perfis de tensão celular podem ser mapeados usando uma única pilha de imagens 3D de uma célula de interesse. Nosso objetivo com esta metodologia é tornar a microscopia de força de tração uma ferramenta mais acessível e mais fácil de implementar para pesquisadores que estudam processos de mecanotransdução celular, especialmente os recém-chegados ao campo.

Introduction

A microscopia de força de tração (TFM) é o processo de aproximação das tracções celulares, utilizando campos de deslocamento interpolados de marcadores de geração de células, gerados por uma célula aderente e contrátil. Usando TFM, a influência de pistas mecânicas no ambiente extracelular em importantes processos celulares como proliferação, diferenciação e migração pode ser investigada^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12}. Infelizmente, muitas abordagens existentes podem ser difíceis de implementar ou exigir familiaridade com ferramentas analíticas e computacionais altamente especializadas, tornando a TFM difícil para os pesquisadores inexperientes usarem. Nós descrevemos uma metodologia para gerar uma plataforma de TFM que elimine alguma da dificuldade na análise ao igualmente fornecer a aquisição de dados da elevado-taxa de transferência.

Das aproximações existentes de TFM, o mais geralmente usado para quantificar a tensão material envolve a incorporação de marcadores fluorescentes pequenos (tipicamente grânulos fluorescentes nano-ou micrômetro-feitos medida) em um Hydrogel deformável, tal como o poliacrilamida (PAA) ou poli (etileno glicol) diacrylate (Pegda)^13,14,15. Essas abordagens baseadas em talão fornecem a capacidade de densamente agrupar marcadores de confiança em torno de uma célula de interesse para maximizar a amostragem de deslocamento. Infelizmente, a distribuição dos grânulos durante todo o hidrogel não pode diretamente ser controlada assim que a organização Spatial é aleatória. Esta colocação aleatória leva a problemas como grânulos que são muito próximos uns dos outros para resolver com precisão, ou assim espalhar que os patches do substrato produzem dados de baixa qualidade. A incapacidade de prever onde os marcadores de origem estão na ausência de células também cria uma restrição que, para cada conjunto coletado de dados de tração celular, uma imagem de referência adicional dos marcadores subjacentes em um estado relaxado também deve ser capturada. A imagem de referência é necessária para que o deslocamento na imagem forçada possa ser aproximado como a diferença entre as imagens estressadas e não estressados. Para alcançar um estado relaxado, as células que estão sendo medidos são quimicamente relaxado ou completamente removido. Este processo impede frequentemente a aquisição de umas medidas experimentais mais adicionais, inibe estudos a longo prazo da pilha, e limita a taxa de transferência. Uma imagem de referência também requer técnicas de registro de imagem para acomodar a deriva que pode ter ocorrido durante a experimentação, muitas vezes levando a uma combinação manual complicada de imagens de estado de stress para fazer referência a imagens.

Outros métodos de TFM considerados livres de referência, implementam alguma forma de controle sobre a distribuição de marcadores de uma espécie, seja por litografia de alta resolução, impressão de microcontato ou micromoldagem^{16,17,18 ,19,20}. A TFM sem referência é alcançada através do pressuposto de que o estado relaxado para cada marcador de produção pode ser previsto com base em como as posições dos marcadores foram prescritas durante o processo de fabricação. Esses métodos permitem a captura completa do estado de tensão de uma célula dentro de uma única captura de imagem na qual os deslocamentos de marcador de referência são medidos em comparação com um referencial implícito do que pode ser inferido a partir da geometria do marcador de origem. Embora a consistência na colocação do marcador seja tipicamente alcançada usando essas plataformas, elas geralmente sofrem de suas próprias deficiências em relação às abordagens baseadas em talão amplamente utilizadas, incluindo: 1) diminuição da resolução de tração; 2) diminuição da precisão dos deslocamentos fora do plano (em alguns casos, uma completa incapacidade de medir); e 3) diminuição da customizabilidade dos substratos e materiais da plataforma (por exemplo, apresentação de ligantes, propriedades mecânicas).

Para abordar essas deficiências, projetamos uma nova plataforma TFM sem referência. A plataforma utiliza a química ativada multifóton para Crosslink um pequeno volume de um fluoróforo em locais 3D específicos dentro do hidrogel que servem como marcadores para medir a cepa material. Desta maneira, nós projetamos uma plataforma que opere similarmente às aproximações grânulo-baseadas mas com o benefício significativo que os marcadores de base são organizados em matrizes gridded permitindo o seguimento material referência-livre da tensão. Esta propriedade livre de referência oferece muitas vantagens. Em primeiro lugar, ele permite o monitoramento não intrusivo dos Estados de tração celular (ou seja, contorna a necessidade de relaxar ou remover células para adquirir posições de referência de marcadores de condensação deslocados). Este era nosso objetivo preliminar em projetar este sistema, como nós pretendemos incorporar outros métodos analíticos a jusante em conjunto com o TFM, que pode ser difícil com aproximações destrutivas do ponto final TFM. Em segundo lugar, usando uma referência implícita com base em matrizes de grade permite a automação Near-Complete da análise de deslocamento. A regularidade das matrizes cria um fluxo de trabalho previsível em que a ocorrência de casos excepcionais (ou seja, dados de células de amostra contendo artefatos inesperados, como espaçamento de marcador suboptimal ou incombinações de registro) podem ser mantidos no mínimo. Em terceiro lugar, renunciar à necessidade de adquirir uma imagem de referência fornece a liberdade de monitorar muitas células em uma única amostra durante longos períodos de tempo. Isso contrasta com as abordagens tradicionais baseadas em esferas, onde, dependendo da fidelidade dos movimentos automáticos de estágio do microscópio, erros no posicionamento podem acumular e aumentar a dificuldade de registrar corretamente as imagens de referência à tensão celular Imagens. Globalmente, esta plataforma facilita uma maior taxa de transferência na recolha de dados de tensão celular.

Com este protocolo, esperamos familiarizar os leitores com a técnica de litografia de digitalização a laser de dois fótons que implementamos para gerar esta plataforma TFM sem referência para medir os componentes de tração no plano e fora do plano gerados pelas células semeadas na superfície. Não coberto neste protocolo é a síntese de alguns dos componentes monoméricos. Em geral, essas reações incluem esquemas de reação de síntese quase idênticos de “um pote” descritos anteriormente²¹, e alternativas para esses produtos também podem ser compradas. Também pretendemos familiarizar os leitores com as ferramentas baseadas em software que geramos para promover o uso de microscópios de digitalização a laser comercialmente disponíveis como ferramentas de impressão 3D e para facilitar a análise de deslocamentos de marcadores de base.

Protocol

1. fotopolimerização de um hidrogel base PEGDA Coleta de reagentes Colete o lítio Phenyl-2, 4, 6-trimetilbenzoilfosforato (colo), 3,4 kDa poli (etileno) diacrilato de glicol (Pegda), n-vinil pirrolidona (NVP), alexafluor 488 rotulado Pegda (PEG-488), alexafluor 633 rotulado Pegda (PEG-633), e peptídeo pegylated RG PEG-RGDS) de seus respectivos freezers e trazer cada um para a temperatura ambiente. Em tubos de microcentrífuga âmbar separados, meça 3 mg de LAP, 10 mg …

Representative Results

Ao longo do protocolo, há uma série de pontos de verificação que fornecem feedback para avaliar a qualidade do procedimento de padronização. Para fornecer alguma introspecção a respeito de como avaliar o progresso em cada um destes checkpoints, nós fornecemos resultados representativos de um experimento real. Os resultados evidenciam a aplicação deste protocolo realizado em um hidrogel fotomodelado preparado para análise de TFM de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Os resultados incluem d…

Discussion

O objetivo deste protocolo é fornecer um fluxo de trabalho que alivia grande parte da dificuldade associada à geração e análise de dados de TFM. Uma vez preparados, os hidrogéis fotomodelados são simples de usar, exigindo apenas conhecimento de práticas padrão de cultura tecidual e microscopia de fluorescência. O aspecto livre de referência permite a navegação descuidadas em hidrogéis carregados de células e elimina etapas de processamento de imagens complicadas, como registro de imagem entre imagens de re…

Materials

Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding	Pall	PN 4602	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips	in-house	in-house	Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome	Zeiss		Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil	3M		Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880	Zeiss		Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter	USCutter	SC631E	Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633	in-house	in-house	Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA	in-house	in-house	Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS	in-house	in-house	RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes	CELLTREAT	229638	8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097358-1004	For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp	UVP	Blak-Ray® B-100AP	Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.