Stima stereologica della lunghezza della fibra colinergica nel Nucleus Basalis di Meynert del cervello del topo
Summary
Lunghezza della fibra neuronale all’interno di una struttura tridimensionale di una regione del cervello è un parametro affidabile per quantificare specifica integrità strutturale neuronale o degenerazione. Questo articolo descrive in dettaglio un metodo di quantificazione stereologica per misurare la lunghezza della fibra colinergica all’interno del nucleo basalis di Meynert nei topi come esempio.
Abstract
La lunghezza degli assoni colinergici o di altri neuronali in varie regioni del cervello è spesso correlata con la funzione specifica della regione. La stereologia è un metodo utile per quantificare i profili neuronali di varie strutture cerebrali. Qui forniamo un protocollo di stereologia basato su software per stimare la lunghezza totale delle fibre colinergiche nel nucleo basalis di Meynert (NBM) del prosencefalo basale. Il metodo utilizza una sonda a sfera spaziale per le stime di lunghezza. Le fibre collinergiche sono visualizzate da colina acetiltransferasi (ChAT) immunostaining con il rafano peroxidase-diaminobenzidina (HRP-DAB) sistema di rilevamento. Il protocollo di colorazione è valido anche per la stima della fibra e del numero di cellule in varie regioni del cervello utilizzando software di stereologia. Il protocollo di stereologia può essere utilizzato per la stima di eventuali profili lineari come fibre coccolincettive, fibre dopaminergiche/catecholaminergiche, fibre sitonergiche, processi astrociti, o anche profili vascolari.
Introduction
Le stime quantitative della lunghezza e/o della densità delle fibre nervose nel cervello sono parametri importanti degli studi neuropatologici. La lunghezza degli assoni colinergici, dopaminergici e sierotonergici in varie regioni del cervello sono spesso correlati con le funzioni specifiche della regione. Poiché la distribuzione di questi assoni è generalmente eterogenea, la stereologia basata sulla progettazione viene utilizzata per evitare distorsioni durante il campionamento. La sonda spaziale di stereologia è stata progettata per fornire misure efficienti e affidabili di strutture simili a linee come le fibre neuronali in una regione di interesse1. La sonda crea una sfera virtuale che viene imposta sistematicamente nel tessuto per misurare le intersezioni della linea con la superficie della sonda. Poiché è impossibile inserire sonde di sfera nel tessuto per l’analisi, il software disponibile in commercio fornisce una sfera tridimensionale virtuale (3D), che è fondamentalmente una serie di cerchi concentrici di vari diametri che rappresentano la superficie della sonda di sfera.
La neurodegenerazione colinergica selettiva è una delle caratteristiche coerenti del morbo di Alzheimer (AD)2,3,4. Trasmissione colinergica disfunzionale è considerato un fattore causale per il declino cognitivo in AD. Disfunzione colinergica è evidente anche in molti altri disturbi mentali come il morbo di Parkinson, dipendenza, e schizofrenia. Diversi aspetti della neurodegenerazione colinergica sono studiati in modelli animali (ad esempio, riduzione dell’acetilcolina5, proteina ChAT6, neurodegenerazione della fibra colinergica in prossimità di placche amiloidi6, e diminuzione delle fibre colinergiche e varicosità sinaptiche7,8). Degenerazione di fibra è creduto per avvenire prima della perdita neuronale, perché la perdita neuronale colinergica non è sempre osservata negli studi. La maggior parte dei neuroni colinergici sono nel prosencefalo basale e il tronco encefalico, e loro assoni proiettano in varie regioni del cervello come le cortici e l’ippocampo. NBM è situato nel prosencefalo basale e si trova ad essere una delle aree del cervello comunemente colpite in AD.
Il metodo frazionario della stereologia si basa sul campionamento casuale sistematico di un tessuto a più livelli. La frazione di campionamento di sezione (SSF) è il campionamento sistematico non basato su computer delle sezioni per il metodo frazionario della stereologia. La frazione di campionamento dell’area (ASF) è la frazione di un’area dell’area di interesse nella sezione. La frazione di campionamento dello spessore (TSF) è la frazione dello spessore di una sezione. La sonda spaziale a sfera ci permette di quantificare i profili di interesse in una sfera 3D in posizioni frazionate. Qui usiamo una sonda a sfera spaziale per stimare la lunghezza totale delle fibre colinergiche nella NBM del cervello del topo per illustrare le procedure. Il protocollo attuale fornisce dettagli sull’elaborazione dei tessuti, sui metodi di campionamento per la stereologia, sulla colorazione immunoistochimica che utilizza l’anticorpo ChAT e sulla stereologia imparziale per stimare la lunghezza della fibra colinergica e la densità delle fibre nella NBM del cervello del topo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui dimostriamo un metodo per stimare la densità delle fibre colinergiche nel NBM utilizzando una sonda palla spaziale (sfera). Questa sonda stima la lunghezza totale della fibra nella regione di interesse. La lunghezza totale può essere divisa per il volume della regione per ottenere la densità della fibra. Per stimare il volume della regione, è stato utilizzato il metodo di conteggio punti Cavalieri. Il metodo di conteggio punti Cavalieri è uno stimatore imparziale ed efficiente di un volume di riferimento 3D per …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a W.E.S. dal Servizio di Ricerca e Sviluppo Medica, dal Dipartimento degli Affari Veterani (Recensione del Merito 1I01 BX001067-01A2), dall’Alzheimer (NPSPAD-11-202149) e dalle risorse del Midwest Biomedical Fondazione di Ricerca.
Materials
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
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