Estimation stéréologique de la longueur de la fibre cholinergique dans le noyau Basalis de Meynert du cerveau de souris
Summary
La longueur de fibre neuronale dans une structure tridimensionnelle d’une région de cerveau est un paramètre fiable pour quantifier l’intégrité structurale neuronale spécifique ou la dégénérescence. Cet article détaille une méthode de quantification stéréologique pour mesurer la longueur de fibre cholinergique dans le basalis de noyau de Meynert chez les souris comme exemple.
Abstract
La longueur des axones cholinergiques ou autres neurones dans diverses régions du cerveau sont souvent corrélées avec la fonction spécifique de la région. La stéréologie est une méthode utile pour quantifier les profils neuronaux de diverses structures cérébrales. Ici, nous fournissons un protocole de stéréologie basé sur un logiciel pour estimer la longueur totale des fibres cholinergiques dans le noyau basalis de Meynert (NBM) du cerveau avant basal. La méthode utilise une sonde de boule d’espace pour des estimations de longueur. Les fibres cholinergiques sont visualisées par l’immunostaining d’acétyltransferase de choline (ChAT) avec le système de détection de peroxidase-diaminobenzidine de raifort (HRP-DAB). Le protocole de coloration est également valide pour l’estimation des fibres et des numéros de cellules dans diverses régions du cerveau à l’aide d’un logiciel de stéréologie. Le protocole de stéréologie peut être employé pour l’estimation de n’importe quels profils linéaires tels que les fibres cholinoceptives, les fibres dopaminergiques/catécholaminergiques, les fibres sérotonergiques, les processus d’astrocyte, ou même les profils vasculaires.
Introduction
Les estimations quantitatives de la longueur et/ou de la densité des fibres nerveuses dans le cerveau sont des paramètres importants des études neuropathologiques. La longueur des axones cholinergiques, dopaminergiques et sérotoninergiques dans diverses régions de cerveau sont souvent corrélées avec les fonctions spécifiques de la région. Étant donné que la distribution de ces axones est généralement hétérogène, la stéologie basée sur la conception est utilisée pour éviter les biais lors de l’échantillonnage. La sonde de boule d’espace de la stéréologie a été conçue pour fournir des mesures efficaces et fiables des structures de ligne-comme telles que les fibres neuronales dans une région d’intérêt1. La sonde fait une sphère virtuelle qui est imposée systématiquement dans le tissu pour mesurer les intersections de ligne avec la surface de la sonde. Parce qu’il est impossible de mettre des sondes de sphère dans le tissu pour analyse, le logiciel disponible dans le commerce fournit une sphère virtuelle en trois dimensions (3D), qui est essentiellement une série de cercles concentriques de différents diamètres qui représentent la surface de la sonde sphère.
La neurodégénérescence cholinergique sélective est l’une des caractéristiques constantes de la maladie d’Alzheimer (MA)2,3,4. La transmission cholinergique dysfonctionnelle est considérée comme un facteur causal pour le déclin cognitif dans la MA. Le dysfonctionnement cholinergique est également évident dans beaucoup d’autres désordres mentaux tels que Parkinson, dépendance, et schizophrénie. Différents aspects de la neurodégénérescence cholinergique sont étudiés dans les modèles animaux (par exemple, réduction de l’acétylcholine5, protéine ChAT6, neurodégénérescence des fibres cholinergiques à proximité des plaques amyloïdes6, et diminution des fibres cholinergiques et des varicosities synaptiques7,8). On croit que la dégénérescence des fibres a lieu plus tôt que la perte neuronale, parce que la perte neuronale cholinergique n’est pas toujours observée dans les études. La plupart des neurones cholinergiques sont dans le cerveau avant basal et le tronc cérébral, et leurs axones projettent à diverses régions du cerveau telles que les cortices et l’hippocampe. NBM est situé dans le cerveau avant basal et s’est avéré être l’une des zones cérébrales couramment affectées dans la MA.
La méthode fractionnée de la stérilologie est basée sur l’échantillonnage aléatoire systématique d’un tissu à plusieurs niveaux. La fraction d’échantillonnage de section (SSF) est l’échantillonnage systématique non informatisé des sections pour la méthode fractionnée de la stérilisation. La fraction d’échantillonnage de surface (ASF) est la fractionnement d’une zone de la région d’intérêt dans la section. La fraction d’échantillonnage d’épaisseur (TSF) est la fractionnement de l’épaisseur d’une section. La sonde de boules spatiales nous permet de quantifier les profils d’intérêt dans une sphère 3D à des endroits fractionnés. Ici, nous utilisons une sonde de boule d’espace pour l’estimation de la longueur totale des fibres cholinergiques dans le NBM du cerveau de souris pour illustrer les procédures. Le protocole actuel fournit des détails sur le traitement des tissus, les méthodes d’échantillonnage pour la stérilologie, la coloration immunohistochimique à l’aide de l’anticorps ChAT, et la stéréologie impartiale pour estimer la longueur des fibres cholinergiques et la densité des fibres dans le NBM du cerveau de souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous démontrons une méthode pour estimer la densité des fibres cholinergiques dans le NBM à l’aide d’une boule spatiale (sphère) sonde. Cette sonde estime la longueur totale de la fibre dans la région d’intérêt. La longueur totale peut être divisée par le volume de la région pour obtenir la densité de fibre. Pour estimer le volume de la région, la méthode de comptage des points Cavalieri a été utilisée. La méthode de comptage des points Cavalieri est un estimateur impartial et efficace d’un volume …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyé par des subventions accordées à W.Z.S. par le Service de recherche et de développement médicaux, le ministère des Anciens Combattants (Examen du mérite 1I01 BX001067-01A2), l’Alzheimer’s Association (NPSPAD-11-202149) et des ressources de la Midwest Biomedical Fondation de recherche.
Materials
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
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