Stereologisk uppskattning av kolinerga fiberlängd i Nucleus Basalis av Meynert av musen hjärnan
Summary
Neuronal fiber längd inom en tredimensionell struktur i en hjärna region är en tillförlitlig parameter för att kvantifiera specifika neuronal strukturell integritet eller degeneration. Denna artikel beskriver en stereologisk kvantifieringmetod för att mäta kolinerga fiberlängd inom kärnan basalis av Meynert hos möss som ett exempel.
Abstract
Längden på kolinerga eller andra neuronala axoner i olika hjärnregioner är ofta korrelerade med den specifika funktionen i regionen. Stereology är en användbar metod för att kvantifiera neuronala profiler av olika hjärnstrukturer. Här tillhandahåller vi ett mjukvarubaserat stereologiprotokoll för att uppskatta den totala längden på kolinerga fibrer i kärnan basalis av Meynert (NBM) av basala forebrain. Metoden använder en rymdkulasond för längduppskattningar. Kolinerga fibrer visualiseras av kolin acetyltransferas (ChAT) immunostaining med pepparrot peroxidas-diaminobenzidin (HRP-DAB) detekteringssystem. Färgningsprotokollet gäller även för fiber- och cellnummeruppskattning i olika hjärnregioner med stereologiprogramvara. Stereology protokollet kan användas för uppskattning av eventuella linjära profiler såsom cholinoceptive fibrer, dopaminerga/katekolaminerga fibrer, serotonerga fibrer, astrocytprocesser, eller till och med vaskulära profiler.
Introduction
Kvantitativa uppskattningar av längd och/eller densitet av nervfibrer i hjärnan är viktiga parametrar för neuropatologiska studier. Längden på kolinerga, dopaminerga och serotonerga axoner i olika hjärnregioner är ofta korrelerade med de specifika funktionerna i regionen. Eftersom fördelningen av dessa axoner är i allmänhet heterogena, design-baserade stereology används för att undvika bias under provtagning. Rymdkulan sonden av stereology har utformats för att ge effektiva och tillförlitliga åtgärder av linjeliknande strukturer såsom neuronala fibrer i en region av intresse1. Sonden gör en virtuell sfär som införs systematiskt i vävnaden för att mäta linjekorsningar med sondens yta. Eftersom det är omöjligt att sätta sfärsonder i vävnaden för analys, ger kommersiellt tillgänglig programvara en virtuell tredimensionell (3D) sfär, vilket i grunden är en serie koncentriska cirklar av olika diametrar som representerar ytan av sfärsonden.
Selektiv kolinerg neurodegeneration är en av de konsekventa funktionerna i Alzheimers sjukdom (AD)2,3,4. Dysfunktionella kolinerga överföring anses vara en orsakande faktor för kognitiv försämring i AD. Kolinerga dysfunktion är också tydligt i många andra psykiska störningar såsom Parkinsons, missbruk och schizofreni. Olika aspekter av kolinerga neurodegeneration studeras i djurmodeller (t.ex. minskning av acetylkolin5, ChAT protein6, kolinerga fiber neurodegeneration i närheten av amyloid plack6, och minskning av kolinerga fibrer och synaptiska ådokokelser7,8). Fiber degeneration tros äga rum tidigare än neuronal förlust, eftersom kolinerga neuronal förlust inte alltid observeras i studier. De flesta av kolinerga nervceller är i basala forebrain och hjärnstammen, och deras axoner projekt till olika hjärnregioner såsom cortices och hippocampus. NBM ligger i basala forebrain och visar sig vara en av de vanliga drabbade hjärnområdena i AD.
Fraktioneringsmetoden för stereologi baseras på systematisk slumpmässig provtagning av en vävnad på flera nivåer. Sektionsprovtagningsfraktion (SSF) är den icke-datorbaserade systematiska provtagningen av avsnitt för fraktioneringsmetoden för stereologi. Arealprovtagningsfraktionen (ASF) är fraktionering av ett område i regionen av intresse i avsnittet. Tjocklek provtagning fraktion (TSF) är fraktionering av tjockleken på ett avsnitt. Rymdkulant gör det möjligt för oss att kvantifiera profiler av intresse i en 3D-sfär på fraktionerade platser. Här använder vi en rymdkulasond för uppskattning av den totala längden på kolinerga fibrer i NBM av mus hjärnan för att illustrera förfarandena. Det nuvarande protokollet innehåller detaljer om vävnadbearbetning, provtagningsmetoder för stereologi, immunohistochemical färgning med chat antikropp, och opartisk stereology att uppskatta kolinerga fiber längd och fiber densitet i NBM av mus hjärnan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här visar vi en metod för att uppskatta tätheten av kolinerga fibrer i NBM med hjälp av en rymdkula (sfär) sond. Denna sond uppskattar den totala fiberlängden i intresseregionen. Den totala längden kan delas av volymen i regionen för att få fiberdensiteten. För att uppskatta volymen i regionen användes cavalieri-poängräkningsmetoden. Cavalieri punkträkningsmetoden är en opartisk och effektiv estimator av en 3D-referensvolym för alla regioner. Metoden beräknar en uppskattning av området på en snittyta i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag till WZS från Medical Research and Development Service, Department of Veterans Affairs (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), Alzheimers Association (NPSPAD-11-202149), och resurser från Midwest Biomedical forskningsstiftelsen.
Materials
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
References
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
- Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer’s disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
- Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
- Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer’s disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
- Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
- Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
- He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Mouton, P. R. . Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).
- West, M. J. Getting started in stereology. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).
- West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
- Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
- Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology–reconsidered. Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).
- Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer’s disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
- McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
- Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
- Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
- Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).
