신경 줄기/전구 세포는 세포 이벤트의 다른 결과로 이끌어 내는 노치 신호 분대의 각종 표현 역학을 전시합니다. 이러한 동적 발현은 유전자 발현의 급격한 변화를 시각화할 수 있는 매우 민감한 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 정적 분석이 아닌 실시간 모니터링을 통해 밝혀질 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
노치 신호는 세포-세포 상호 작용에 의해 신경 줄기/전구 세포의 유지 를 조절합니다. 노치 시그널링의 구성 요소는 동적 표현을 나타낸다. 노치 시그널링 이펙터 Hes1 및 노치 리간드 델타 유사1(Dll1)은 신경 줄기/전구 세포에서 진동 방식으로 발현된다. 이들 유전자의 진동 발현 기간이 매우 짧기 때문에(2시간), 그들의 순환 발현을 모니터링하기가 어렵다. 유전자 발현 또는 단백질 역학의 이러한 급격한 변화를 검토하기 위해서는 빠른 반응 리포터가 필요합니다. 그것의 빠른 성숙 역학 및 높은 감도 때문에, 생물 발광 리포터 luciferase는 살아있는 세포에 있는 급속한 유전자 발현 변경을 감시하기 위하여 적당합니다. 우리는 단세포 분해능에서 단백질 역학의 시각화를 위해 프로모터 활성을 모니터링하기 위해 불안정한 루시퍼라제 리포터와 루시퍼라제 융합 리포터를 사용했습니다. 이러한 생물 발광 리포터는 빠른 회전율을 보여주고 매우 약한 신호를 생성합니다. 따라서, 우리는 그러한 희미한 신호를 검출하기 위해 매우 민감한 생물 발광 이미징 시스템을 개발했습니다. 이 방법을 사용하면 실제 세포 상태를 이해하는 데 도움이되는 중요한 정보인 살아있는 세포 및 조직에서 다양한 유전자 발현 역학을 모니터링 할 수 있습니다.
서론
포유류 뇌는 다양한 유형의 뉴런 및 신경교 세포로 구성되어 있습니다. 모든 세포는 신경 줄기 / 전구 세포 (NPC)에서 생성되며, 이는 먼저 그 수를 확장하기 위해 증식한 다음 뉴런으로 분화하기 시작하고 마지막으로 신경교세포1,2,3,4,5를발생시다. 일단 세포가 뉴런으로 분화되면, 그(것)들은 증식하거나 그들의 수를 증가할 수 없고, 그러므로, 나중 단계까지 NPC의 유지보수가 중요합니다. 세포-세포 상호 작용을 통한 노치 신호는 NPC6,7을유지하는 데 중요한 역할을 한다. 노치 리간드막 단백질, 노치, 이웃 세포의 표면에 상호 작용하고 노치 단백질을 활성화합니다. 활성화 후, 노치 단백질의 단백질 해가 발생하여 세포막에서 노치 (NICD)의 세포 내 도메인을 핵8,9,<....
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프로토콜
동물 과목을 포함한 모든 절차는 교토 대학 프론티어 생명 의학 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 생물 발광 기자
참고: 루시퍼라제 리포터는 분해 신호를 융합하여 프로모터 활성의 급속한 역학을 측정하는데 적합합니다. 더욱이, 루시퍼라제 융합 리포터는 단일 세포내의 단백질 역학을 모니터링할 수 있게 한다. 두 유형의 리포터는 단층 배양(해리 문화) 및 조직 배양(슬라이스 배양) 실험에 사용할 수 있다.
- Dll1 프로모터 활동 모니터링을 위한 리포터17
참고: 유전자 발현의 급격한 변화를 모니터링하려면 신속한 반응과 불안정한 리포터가 필수적입니다. 반딧불이 루시퍼라제(Fluc)는 플루오레세인 리포터에 비해 빠른 성숙을 나타낸다. 유비퀴틴 융합 루시퍼라제 리포터(Ub-Fluc)는 급격한 분해 및 빠른 회전율을 나타내기 때문에, 살아있는세포(20)에서동적 유전자 발현을 모니터링하는 것이 매우 유용하다.- Dll1 프로모터 구동 불안정루시퍼라제 리포터, 유비퀴틴화 루시퍼라제(pDll1-Ub-Fluc, 도 1
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결과
Hes1/7 유전자의 발현은 다양한 세포주 및 소미토제네시스 동안2시간 진동 주기를 나타낸다. 게다가, 진동의 기간은 아주 짧고 그들의 mRNAs와 단백질 둘 다 약 20 분의 반감기와 극단적으로 불안정합니다. 느린 반응 리포터를 사용하는 경우, 우리는 이러한 급속한 역학을 추적 할 수 없으며, 안정적인 리포터를 사용하는 경우, 유전자 발현이 진동하는 동안 점차적으로 축적됩니다. 따라서, 리포터는 이러한 순환 발현 유전자의 급속한 회전율을 모니터링하기 위해 급속히 분해되어야 한다. 이러한 문제를 극복하기 위해 우리는 루시퍼라제 리포터를 사용하여 발진기의 동적 표현을 모니터링했습니다. 생물 발광 리포터는 짧은 성숙 시간과 높은 감도를 가지고 있기 때문에, 그것은 우리가 초경 발진기의 급속한 역학을 모니터링 할 수 있습니다. 형광 리포터와 마찬가지로, 루시퍼라제 리포터는 유전자 코딩 서열에 융합됨으로써 단백질의 발현 역학을 모니터링할 수있다(도 1A.......
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토론
노치 시그널링의 구성 요소는 소미토 발생 시 동기화시 진동 발현을 나타내지만 신경 발생 시 동기화되지 않은 것으로 나타나며, 후자의 경우 정적 분석에 의한 발현 역학을 포착하는 데 어려움을 초래합니다. 따라서, 실시간 모니터링은 Hes1 및 Dll1과같은 노치 신호 구성 요소의 발현 역학을 밝히기 위해 요구된다. Hes1 및 Dll1 진동의 발현 기간이 매우 짧기 때문에 약 2-3시간 동안 신속한 응답과 불안정한 리포터가 표현 역학을 모니터링해야 합니다. 이를 위해 생물 발광 리포터 및 이미징 시스템을 개발했습니다. 생물 발광 리포터 루시퍼라제는 이러한 순환 유전자 발현의 빠른 회전율을 추적하기 위해 급속한 성숙 역학 및 고감도를 나타낸다. 기자의 급속한 회전율은 매우 희미한 신호생성으로 이어집니다. 생물 발광 리포터가 생성한 희미한 신호를 감지하기 위해, 우리는 고감도, 초저 판독 속도(50kHz)의 수냉식 CCD 카메라를 포함한 최적화된 생물 발광 이미징 시스템.......
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공개 사항
저자는 상충하는 재정적 이익이 없습니다.
감사의 글
이와모토 유미코에게 동영상 제작을 지원해 주신 것에 대해 감사드립니다. 또한 이미지 분석의 논의와 지원에 대한 이소무라 아키히로, 형질전환 동물 생성을 위한 기술 지원을 위한 미야치 히토시, 신조 유지(올림푸스 의학), 에가와 마사토시(올림푸스 의학), 이시즈 다쿠야() 올림푸스 의학)과 우인 쿠니타키(Andor Japan)는 생물 발광 이미징 시스템의 기술 지원 및 논의를 위해 이 작품은 진화 과학 기술에 대한 핵심 연구에 의해 지원되었다 (JPMJCR12W2) (R.K.), 혁신적인 영역에 대한 과학 연구를위한 보조금 에이드 (MEXT 24116705 H.S. 및 MEXT 16H06480 R.K.에 대한), 과학 연구를위한 보조금 지원 (C) (JPSPs) 18K06254) (H.S.), 다케다 재단 (R.K. 및 H.S.), 그리고 교육, 문화, 스포츠, 과학 기술, 일본에서 생활 시스템에 대한 동적 접근을위한 플랫폼.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | 모델: F12-ED | |
| 냉각 CCD 카메라 | Andor 기술 | 모델: iKon-M 934 | |
| 인큐베이터 시스템 | TOKAI HIT | 모델: INU-ONICS | |
| 도립 현미경 | Olympus | 모델: IX81 | |
| 도립 현미경 | 올림푸 | 모델: IX83 | |
| LED 조명 장치 | CoolLED | 모델: pE1 | |
| MetaMorph | 분자 장치 | 모델: 40000 | |
| 혼합 가스 컨트롤러 | Tokken | 모델: TK-MIGM OLO2 | |
| 대물 렌즈 | 올림푸스 | 모델: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | 모델: SMZ-2B | |
| 형광 실체 현미경 | Leica | 모델: MZ16FA | |
| 미세 집게 | DUMONT | INOX No.5 | |
| 가위, 마이크로 가위 | |||
| 집게 | |||
| 고리 모양의 집게 | |||
| 10cm 플라스틱 페트리 접시 | greiner | 664160-013 | |
| 35mm 플라스틱 페트리 접시 | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| NPC용 시약 해리 배양 | |||
| B27 보충제 | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | 재고 솔루션: 1 μ 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | 원액: 0.9% 식염수 |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | |
| 유리 바닥 접시 | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 보충제(100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | 재고 용액: EBSS |
| 페니실린/스트렙마이신 | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparation for in utero electroporation | |||
| 50-ml 주사기 | TERUMO | 181228T | |
| 전극 | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| 겸자 | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| 마이크로 모세관 | 사제 | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| 링 형 집게 | |||
| 가위, 마이크로 가위 | |||
| 봉합 바늘 | 아키야마 MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparation for Slice culture | |||
| 10-cm 플라스틱 페트리 접시 | Greiner | 664160-013 | |
| 35-mm 플라스틱 페트리 접시 | Greiner | 627160 | |
| 배양 인서트 | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| 소 태아 혈청 | 시그마 | 172012-500ML | |
| 미세 집게 | DUMONT | INOX No.5 | |
| 집게 | |||
| 세럼 | Gibco | 16050-122 | |
| 마이크로 수술 칼 | Alcon | 19 게이지 V-Lance | |
| 다중 가스 인큐베이터 | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2 / B27 미디어 | 사내 | 제작 참조 NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| 링 모양의 집게 | |||
| 가위, 마이크로 가위 | |||
| 실리콘 고무 도마 | 사내 |
참고문헌
- Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
- Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience....
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