通过旋转磁盘显微镜在单极式斜接主轴中测量微管动力学

Summary

在这里，我们提出了一个强大而详细的微管动力学分析方法，在预元相中同步的细胞使用活细胞旋转磁盘共聚焦显微镜和基于MATLAB的图像处理。

Abstract

我们描述了对确定活细胞中微管动力学的既定方法的修改。该协议基于微管正端（EB3标有tdTomato荧光蛋白）的遗传编码标记的表达，以及使用旋转盘共聚焦显微镜的高速、高分辨率活细胞成像。通过抑制线细胞中的中位体分离，实现细胞周期同步和微管密度的增加，并使用开源U-Track软件进行生长分析。使用明亮和红色转移荧光蛋白，结合较低的激光功率和减少曝光时间所需的旋转盘显微镜减少光毒性和光诱导伪影的可能性。这允许在相同的制备中成像更多细胞，同时在标准培养条件下将细胞保持在生长培养基中。由于分析以受监督的自动方式执行，因此结果在统计上是可靠的，可重现。

Introduction

微管（MTs）是几乎所有真核细胞和某些^细菌1中发现的高度动态结构。与蛋白和中间丝一起，他们雕刻细胞^{骨架2，3。}细胞^分裂4，分子^传输5，鞭拉^击6，感觉周围环境通过原发性^硅7，听力（基诺西）8，9，胚胎发生10，11，12，入侵和^{转移13，14，}甚至记忆形成15，16，17，18，和许多其他过程主要依赖于MT。如果没有在生长（聚合）和收缩（去聚合）之间快速切换的非凡能力，那么，在所有这些事件中，如果MT的参与是不可能的。此属性被描述为动态不稳定¹⁹。MT动态性在许多病理条件下改变20，21，22。因此，确定此属性的性质可以帮助了解疾病机制及其后的治疗。

已经为MT动力学分析开发了一长串的方法，其中大多数都基于成像^技术23。最初，宽场光学显微镜用于观察在体^外24体中形成图布林聚合物。最终结合（EB）蛋白的发现，在MT加端聚集，并开发荧光标记蛋白质的方法，使得在宽场和共聚焦荧光^{显微镜25、26、27}的活细胞中直接观察MT的行为^{成为可能。}一个EB蛋白是最终结合蛋白3（EB3）28;通过过度表达和跟踪EB3融合到荧光蛋白，MT加端组装速率可以^{确定29，30。}

共聚焦激光扫描荧光显微镜（CLSM）经常用于跟踪MT动力学。然而，这种成像技术带来了光毒性和光漂白的高风险，两个不良的过程活细胞和暗淡样品^成像31。为了获得更好的信噪比，激光功率和曝光持续时间应足够高，同时不损坏样品，这需要牺牲分辨率以换取速度。CLSM的一个合适的替代方案是旋转磁盘^{显微镜32。}这种成像模式基于使用Nipkow^磁盘33，它包括一个带有一系列针孔的移动磁盘，并且与许多CLS显微镜同时成像同一^样品34的工作相同。因此，来自激光的光将同时照亮样品中的多个区域，但会保持共聚焦性质。因此，Nipkow 磁盘允许获取类似于 CLSM 的图像，但速度更快，使用更少的激光功率。横川电机进一步改进了Nipkow圆盘，该盘引入了第二个圆盘，上面装有一系列微透镜，可单独将光线定向到各自的针孔中，进一步降低了光毒性和光^漂白35。因此，旋转盘激光扫描显微镜成为活细胞成像的首选方法，并且它使得以^{高速31、36}获得高信噪比的图像成为可能，这对解析来自快速增长的MT端信号至关重要。

MT 动态暂时不同。例如，线粒体MT比相间^的37，38更动态。同样，即使在相同的细胞周期阶段，如米细胞^{炎39，40，}也观察到生长速率和收缩的差异。因此，为了避免错误数据收集，MT 动力学的测量应限制在单元周期中的狭窄时间窗口。例如，通过用二甲基苯丙酮（DME）处理细胞，可以测量预元相中的MT动力学，这是一种抑制运动动蛋白Eg5⁴¹并防止双极线^轴42形成的单体模拟物。用Eg5抑制剂DME和其他单星衍生物抑制细胞在预元相不影响MT动力学43，44，45，这使得DME成为研究固定细胞和活^细胞44MT动力学的有用工具。

在这里，我们将Ertych^等人44描述的prometa相细胞中的MT动力学分析方法与双旋转磁盘成像相结合。该方法允许测量从单个焦平面收集的Prometa相细胞中的MT动力学，成像速率较高，但无光漂白和最小光毒性。此外，作为荧光报告员，我们使用串联二聚体番茄荧光蛋白（tdTomato），与绿色荧光蛋白（EGFP）相比，具有更高的亮度和光稳定性，并且以低能量^光46激发。因此，tdTomato 需要较少的激光功率来激发，并且光毒性更少。总之，通过降低光毒性，提高MT动力学分析所需的分辨率和后处理，进一步完善了该方法。此外，我们通过将方法与其他同步技术相结合，为将来修改该方法奠定基础。

Protocol

1. 赫拉细胞的种子 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中制备 2 mL 的 5 μg/mL 纤维化溶液，并将其加入 4 口井盖玻片 （#1.5） 的每个井中。在37°C和5%CO2下孵育幻灯片15分钟。 用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）冲洗异步生长的HeLa细胞，并在37°C下孵育胰蛋白酶-EDTA（0.05%：0.02%;w：v）。5分钟。停止酶反应添加罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640介质辅以10%热灭活胎儿小牛血清（FCS）在3：…

Representative Results

按照图1A中概述的给定协议，pEB3-tdTomato质粒在异步生长的HeLa细胞中瞬时表达。通过DME治疗在临元相转染后48小时与细胞同步（图1B）。此步骤可确保 MT 动力学的测量始终在细胞周期的同一阶段进行。延时电影被进一步处理和分析与U-Track v2.2.0，如其补充文件50，51，52所述。虽然加端?…

Discussion

在这里，我们描述了Ertych等人^首先建立的方法的修改。除了其他几种修改之外，我们还将这一MT动力学分析技术与双旋转磁盘共聚焦成像相结合。使用双纺盘提高了增长的MT的分辨率，同时降低了光^毒性36。通过切换到长波长荧光报告器，我们进一步减少了光漂白和激光引起的细胞损伤。^与EGFP46相比，tdTomato荧光蛋白具有更高的光稳定性和亮度?…

Materials

Dimethylenastron	Merck	324622
DMEM w/o phenol red	Gibco	31053-28
DPBS	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Biochrom	S0415
Fibronectin Bovine Plasma	Merck	F4759	Sterile powder
GlutaMAX	Gibco	35050-038	Stable glutamine substitutive
jetPRIME	Polyplus	114-15
EB3-TdTomato	Addgene	plasmid #50708
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Trypan Blue	Merck	T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution	Biochrom	L2143	0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide	Ibidi	80426	4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope	Nikon	NA
Objective	Nikon	MRD01991	CFI Apo TIRF 100XC Oil
ACAL Laser Excahnger	Nikon		Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm
Spinning disk module	Andor	CSU-W
Camera	Andor	iXon Ultra 888
Environmental Chamber	Okolab		Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier
HeLa Cells	DSMZ	ACC-57
NIS Elements v4	Nikon		Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB	Mathworks		Computing environment
Prism 8	GraphPad		Statistical analysis and display software