Kwantificering van proliferative en dode cellen in Enteroïden
Summary
Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van flow cytometrie om het aantal vermenigvuldigende en dode cellen in gekweekte muisenteroïden te kwantificeren. Deze methode is nuttig om de effecten van medicamenteuze behandeling op organoïde proliferatie en overleving te evalueren.
Abstract
Het darmepitheel fungeert als een barrière die voorkomt dat de inhoud van de armatuur, zoals pathogene microbiota en toxines, de rest van het lichaam binnendringt. Epitheliale barrière functie vereist de integriteit van darmepitheelcellen. Terwijl epitheelcelproliferatie een continue laag cellen onderhoudt die een barrière vormt, leidt epitheelschade tot barrièredisfunctie. Als gevolg hiervan kan de luminaalinhoud via een onbeperkt pad over de darmbarrière lopen. Disfunctie van de darmbarrière is geassocieerd met veel darmziekten, zoals inflammatoire darmziekte. Geïsoleerde muis darmcrypten kunnen worden gekweekt en onderhouden als crypt-villus-achtige structuren, die worden genoemd intestinale organoïden of “enteroïden”. Enteroïden zijn ideaal om de proliferatie en celdood van darmepitheelcellen in vitro te bestuderen. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode om het aantal proliferative en dode cellen in gekweekte enteroïden te kwantificeren. 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) en propidiumjodide worden gebruikt om woekerende en dode cellen in enteroïden te etiketteren, en het aandeel van vermenigvuldigende en dode cellen wordt vervolgens geanalyseerd door stroomcytometrie. Dit is een nuttig hulpmiddel om de effecten van medicamenteuze behandeling op darmepitheliale celproliferatie en celoverleving te testen.
Introduction
Een fundamentele functie van darmepitheelcellen is het beschermen van de intrede van luminale inhoud zoals pathogene bacteriën en toxines1,2. Om een dergelijke functie uit te voeren, vermenigvuldigen darmstamcellen zich voortdurend en onderscheiden ze zich in een verscheidenheid van epitheelcellen, waaronder enterocyten en secretoire cellen, die een barrière vormen door het vormen van nauwe verbindingen3. De snelle vernieuwing van darmepitheelcellen vereist een strikte coördinatie van celproliferatie, celdifferentiatie en celdood4,5. Verminderde celproliferatie of overmatige celdood leidt tot epitheelschade en gecompromitteerde barrièrefunctie1,6. Disfunctie van de darmbarrière is geassocieerd met inflammatoire darmziekten7,8.
Een methode om darmcrypten te kweken is eerder ontwikkeld. Met behulp van deze techniek groeien geïsoleerde muiscrypten uit tot darmorganoïden (enteroïden), die crypte-villusachtige structuren hebben en alle darmepitheelcellijn9,10bevatten. 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) is een thymidine analoog die in staat is om thymine (T) te vervangen in DNA dat replicatie ondergaat tijdens celproliferatie. De proliferative cellen kunnen snel en nauwkeurig worden gelabeld door EdU kleuring. Propidiumjodide (PI) is een analoog van ethidiumbromide die rode fluorescentie vrijgeeft bij het inbrengen in dubbelstrengs DNA. PI detecteert specifiek dode cellen, omdat het alleen door het beschadigde celmembraan gaat.
In dit protocol beschrijven we eerst hoe crypten uit de dunne darm van murine te isoleren en ze vervolgens te kweken als enteroïden in vitro. Vervolgens beschrijven we hoe de proliferative en dode cellen in enteroïden te analyseren door EdU en PI integratie en flow cytometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor de cultuur van enteroïden in vitro en kwantificering van EdU- en PI-positieve cellen in de enteroïden door stroomcytometrie. Er zijn verschillende voordelen van deze strategie. Ten eerste wordt EdU-etikettering gebruikt om woekercellen in enteroïden te detecteren. In vergelijking met traditionele BrdU-test is de EdU-etiketteringsmethode sneller, gevoeliger en nauwkeuriger. EdU is zeer vergelijkbaar met thymine (T), die thymine vervangt in DNA-synthese tijdens de c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 en 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing University (KF-GN-202004). De Natural Science Foundation van de Jiangsu Higher Education Institutions of China (19KJB320003), The Livelihood and Technology Program of Suzhou City (SYS2019030), en The Research Innovation Program for College Graduates of Jiangsu Province (KYCX19-1981) . Dit werk wordt ook ondersteund door Tang Scholar van Soochow University.
Materials
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
