Quantificazione delle cellule morte e proliferanti negli enteroidi
Summary
Il protocollo presentato utilizza la citometria di flusso per quantificare il numero di cellule proliferatie e morte negli enteroidi dei topi coltivati. Questo metodo è utile per valutare gli effetti del trattamento farmacologico sulla proliferazione e la sopravvivenza degli organiidi.
Abstract
L’epitelio intestinale agisce come una barriera che impedisce al contenuto luminale, come il microbiota patogeno e le tossine, di entrare nel resto del corpo. La funzione di barriera epiteliale richiede l’integrità delle cellule epiteliali intestinali. Mentre la proliferazione delle cellule epiteliali mantiene uno strato continuo di cellule che forma una barriera, il danno epiteliale porta alla disfunzione della barriera. Di conseguenza, il contenuto luminale può attraversare la barriera intestinale attraverso un percorso illimitato. Disfunzione della barriera intestinale è stata associata a molte malattie intestinali, come la malattia infiammatoria intestinale. Le cripte intestinali isolate di topi possono essere coltivate e mantenute come strutture simili a cripte-villusi, che sono definite organoidi intestinali o “enteroidi”. Gli enteroidi sono ideali per studiare la proliferazione e la morte cellulare delle cellule epiteliali intestinali in vitro. In questo protocollo, descriviamo un metodo semplice per quantificare il numero di cellule proliferative e morte negli enteroidi coltivati. 5-ethynyl-2′-deoxyuridina (EdU) e iodio propidio vengono utilizzati per etichettare le cellule proliferanti e morte negli enteroidi, e la proporzione di proliferazione e cellule morte viene quindi analizzata dalla citometria di flusso. Questo è uno strumento utile per testare gli effetti del trattamento farmacologico sulla proliferazione delle cellule epiteliali intestinali e sulla sopravvivenza delle cellule.
Introduction
Una funzione fondamentale delle cellule epiteliali intestinali è quella di proteggere l’ingresso del contenuto luminale come i batteri patogeni e le tossine1,2. Per svolgere tale funzione, le cellule staminali intestinali proliferano continuamente e si differenziano in una varietà di cellule epiteliali, tra cui enterociti e cellule secretorie, che formano una barriera formando connessioni strette3. Il rapido rinnovamento delle cellule epiteliali intestinali richiede un rigoroso coordinamento della proliferazione cellulare, della differenziazione cellulare e della morte cellulare4,5. La riduzione della proliferazione cellulare o l’eccessiva morte cellulare provocano danni epiteliali e la funzione di barriera compromessa1,6. Disfunzione della barriera intestinale è stata associata a malattie infiammatorie intestinali7,8.
In precedenza è stato sviluppato un metodo per la coltura delle cripte intestinali. Utilizzando questa tecnica, cripte di topo isolati crescono in organoidi intestinali (enteroidi), che hanno strutture cripto-villus come e contengono tutta la lignaggio delle cellule epiteliali intestinali9,10. 5-Ethynyl-2′-deoxyuridina (EdU) è un analogo di timina che è in grado di sostituire la timina (T) nel DNA che è sottoposto a replicazione durante la proliferazione cellulare. Le cellule proliferative possono essere etichettate rapidamente e con precisione dalla colorazione EdU. Propidium iodide (PI) è un analogo di bromuro di etidio che rilascia fluorescenza rossa dopo l’inserimento nel DNA a doppio filamento. PI rileva specificamente le cellule morte, dal momento che passa solo attraverso la membrana cellulare danneggiata.
In questo protocollo, descriviamo prima come isolare le cripte dall’intestino piccolo murino poi colture come enteroidi in vitro. Descriviamo quindi come analizzare le cellule proliferative e morte in enteroidi da EdU e PI incorporando e flusso citometria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive in dettaglio i passi necessari per la coltura degli enteroidi in vitro e la quantificazione delle cellule EdU e PI-positive negli enteroidi per citometria di flusso. Questa strategia presenta diversi vantaggi. In primo luogo, l’etichettatura EdU viene utilizzata per rilevare le cellule proliferanti negli enteroidi. Rispetto al tradizionale saggio BrdU, il metodo di etichettatura EdU è più veloce, più sensibile e più preciso. EdU è molto simile alla timina (T), che sostituisce la timina nel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 e 31601022), dalla Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Università di Nanchino (KF-GN-202004). La Natural Science Foundation delle istituzioni di istruzione superiore Jiangsu della Cina (19KJB320003), il programma di sussistenza e tecnologia di Suzhou City (SYS2019030) e il programma di innovazione della ricerca per i laureati universitari della provincia di Jiangsu (KYCX19-1981) . Questo lavoro è supportato anche da Tang Scholar dell’Università di Soochow.
Materials
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
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