Kvantifiering av proliferativa och döda celler i Enteroids
Summary
Det presenterade protokollet använder flödecytometri för att kvantifiera antalet prolifererande och döda celler i odlade musenteroider. Denna metod är användbar för att utvärdera effekterna av läkemedelsbehandling på organoid spridning och överlevnad.
Abstract
Tarmepitelfungerar som en barriär som förhindrar luminalt innehåll, såsom patogent mikrobiota och toxiner, från att komma in i resten av kroppen. Epitelial barriärfunktion kräver integriteten hos tarmepitelceller. Medan epitelial cell spridning upprätthåller ett kontinuerligt lager av celler som bildar en barriär, epitelial skada leder till barriär dysfunktion. Som ett resultat kan luminalinnehåll över tarmbarriären via en obegränsad väg. Dysfunktion av tarmbarriären har associerats med många tarmsjukdomar, såsom inflammatorisk tarmsjukdom. Isolerade mus tarmkryptoter kan odlas och upprätthållas som krypt-villus-liknande strukturer, som kallas intestinalorganoider eller “enteroids”. Enteroids är idealiska för att studera spridningen och celldöd av intestinala epitelceller in vitro. I detta protokoll beskriver vi en enkel metod för att kvantifiera antalet proliferativa och döda celler i odlade enteroider. 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) och propidiumjodid används för att märka prolifererande och döda celler i enteroider, och andelen prolifererande och döda celler analyseras sedan av flödecytometri. Detta är ett användbart verktyg för att testa effekterna av läkemedelsbehandling på intestinalepitelial cellspridning och cellöverlevnad.
Introduction
En grundläggande funktion av intestinala epitelceller är att skydda inträdet av luminalinnehåll såsom patogena bakterier och gifter1,2. För att utföra en sådan funktion förökar sig tarmstamceller kontinuerligt och skiljer sig åt i en mängd olika epitelceller, inklusive enterocyter och sekretoriska celler, som bildar en barriär genom att bilda snäva anslutningar3. Snabb förnyelse av intestinala epitelceller kräver strikt samordning av cellproliferation, celldifferentiering och celldöd4,5. Minskad cellspridning eller överdriven celldöd leder till epitelial skada och komprometterande barriärfunktion1,6. Dysfunktion av tarmbarriären har associerats med inflammatoriska tarmsjukdomar7,8.
En metod för att odla tarmkryptor har utvecklats tidigare. Med hjälp av denna teknik, isolerade mus kryptor växa till intestinala organoider (enteroids), som har kryptan-villus liknande strukturer och innehåller alla intestinala epitelial cell härstamning9,10. 5-Ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) är en tymidin analog som kan ersätta thymine (T) i DNA som genomgår replikation under cellproliferation. De proliferativa cellerna kan snabbt och korrekt märkas av EdU färgning. Propidium jodid (PI) är en analog av ethidiumbromid som frigör röd fluorescens vid insättning i dubbelsträngat DNA. PI upptäcker specifikt döda celler, eftersom det bara passerar genom det skadade cellmembranet.
I detta protokoll beskriver vi först hur man isolerar kryptor från murintunntarmen och kulturen dem som enteroider in vitro. Vi beskriver sedan hur man analyserar proliferativa och döda celler i enteroids av EdU och PI införlivande och flöde cytometri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver de steg som krävs för kulturen av enteroider in vitro och kvantifiering av EdU- och PI-positiva celler i enteroids av flöde cytometri. Det finns flera fördelar med denna strategi. För det första används EdU-märkning för att upptäcka prolifererande celler i enteroider. Jämfört med traditionell BrdU-analys är EdU-märkningsmetoden snabbare, känsligare och mer exakt. EdU är mycket lik thymine (T), som ersätter thymine i DNA-syntes under celldelning. Jämfört med BrdU-antikroppen ä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 och 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Forskningsfonden för statens nyckellaboratorium för farmaceutisk bioteknik, Nanjing universitetar (KF-GN-202004). Natural Science Foundation av Jiangsu högskolor i Kina (19KJB320003), Livelihood and Technology Program i Suzhou City (SYS2019030), och Research Innovation Program för högskoleexamen i Jiangsu-provinsen (KYCX19-1981) . Detta arbete stöds också av Tang Scholar vid Soochow University.
Materials
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
