Quantifizierung von proliferativen und abgestorbenen Zellen in Enteroiden
Summary
Das vorgestellte Protokoll verwendet Diedurchflusszytometrie, um die Anzahl der sich ausbreitenden und abgestorbenen Zellen in kultivierten Mausenteroiden zu quantifizieren. Diese Methode ist hilfreich, um die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die Organoidproliferation und das Überleben zu bewerten.
Abstract
Das Darmepithel wirkt als Barriere, die verhindert, dass Luminalgehalte wie pathogene Mikrobiota und Toxine in den Rest des Körpers gelangen. Die Epithelbarrierefunktion erfordert die Integrität von Darmepithelzellen. Während die Epithelzellproliferation eine kontinuierliche Schicht von Zellen aufrechterhält, die eine Barriere bildet, führt Epithelschädigung zu Barrierestörungen. Dadurch können luminale Inhalte über einen unbeschränkten Weg über die Darmbarriere hinweg. Dysfunktion der Darmbarriere wurde mit vielen Darmerkrankungen verbunden, wie entzündliche Darmerkrankungen. Isolierte Maus-Darmkrypen können als krypto-villus-ähnliche Strukturen kultiviert und gepflegt werden, die als Darmorganoide oder “Enteroide” bezeichnet werden. Enteroide sind ideal, um die Proliferation und den Zelltod von Darmepithelzellen in vitro zu untersuchen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Methode, um die Anzahl der proliferativen und abgestorbenen Zellen in kultivierten Enteroiden zu quantifizieren. 5-Ethynyl-2′-Deoxyuridin (EdU) und Propidiumiodid werden verwendet, um wulässige und abgestorbene Zellen in Enteroiden zu kennzeichnen, und der Anteil der vermehrenden und abgestorbenen Zellen wird dann durch Durchflusszytometrie analysiert. Dies ist ein nützliches Werkzeug, um die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die Proliferation von Darmepithelzellen und das Überleben von Zellen zu testen.
Introduction
Eine grundlegende Funktion der Darmepithelzellen ist es, den Eintrag von leuchtdichtem Inhalt wie pathogenen Bakterien und Toxinen1,2zu schützen. Um eine solche Funktion auszuführen, vermehren sich Darmstammzellen kontinuierlich und differenzieren sich in eine Vielzahl von Epithelzellen, einschließlich Enterozyten und Sekretoretenzellen, die eine Barriere bilden, indem sie enge Verbindungen bilden3. Die schnelle Erneuerung der Darmepithelzellen erfordert eine strikte Koordination der Zellproliferation, Zelldifferenzierung und zelltodigeZellabnutzung 4,5. Reduzierte Zellproliferation oder übermäßiger Zelltod führt zu Epithelschäden und kompromittierter Barrierefunktion1,6. Dysfunktion der Darmbarriere wurde mit entzündlichen Darmerkrankungen in Verbindung gebracht7,8.
Eine Methode zur Kultur von Darmkrypen wurde bereits entwickelt. Mit dieser Technik wachsen isolierte Mauskrypten zu Darmorganoiden (Enteroiden), die krypto-villus-ähnliche Strukturen haben und alle Darmepithelzelllinien9,10enthalten. 5-Ethynyl-2′-Deoxyuridin (EdU) ist ein Thymidin-Analog, das in der Lage ist, Thymin (T) in der DNA zu ersetzen, die während der Zellproliferation vermehrt wird. Die proliferativen Zellen können durch EdU-Färbung schnell und genau beschriftet werden. Propidiumiodid (PI) ist ein Analogon von Ethidiumbromid, das rote Fluoreszenz bei der Einfügung in doppelsträngige DNA freisetzt. PI erkennt gezielt abgestorbene Zellen, da sie nur durch die beschädigte Zellmembran verläuft.
In diesem Protokoll beschreiben wir zunächst, wie man Krypten aus dem murinen Dünndarm isoliert und sie dann als Enteroide in vitro kultiviert. Wir beschreiben dann, wie man die proliferativen und abgestorbenen Zellen in Enteroiden durch EdU und PI-Integration und Durchflusszytometrie analysiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die für die Kultur der Enteroide in vitro und die Quantifizierung von EdU- und PI-positiven Zellen in den Enteroiden durch Durchflusszytometrie erforderlich sind. Diese Strategie hat mehrere Vorteile. Erstens wird die EdU-Kennzeichnung verwendet, um vermehrende Zellen in Enteroiden zu erkennen. Im Vergleich zum herkömmlichen BrdU-Test ist die EdU-Kennzeichnungsmethode schneller, empfindlicher und genauer. EdU ist sehr ähnlich zu Thymin (T), das Thymin in der DNA-Synthese währ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 und 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing Universität (KF-GN-202004). Die Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions of China (19KJB320003), The Livelihood and Technology Program of Suzhou City (SYS2019030) und The Research Innovation Program for College Graduates of Jiangsu Province (KYCX19-1981) . Diese Arbeit wird auch von Tang Scholar von der Soochow University unterstützt.
Materials
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
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