माइक्रोग्लियल घनत्व, मॉर्फोलॉजी और परिधीय माइलॉयड सेल घुसपैठ विश्लेषण माउस मस्तिष्क के लिए आईबीए1 और TMEM119 का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसी
Summary
इस प्रोटोकॉल microglial घनत्व, वितरण, और आकृति विज्ञान, साथ ही माउस मस्तिष्क के ऊतकों में परिधीय माइलॉयड सेल घुसपैठ के विश्लेषण के अलावा, आईबीए 1 और TMEM119 के इम्यूनोफ्लोरेसेंट costaining के लिए एक कदम दर कदम कार्यप्रवाह का वर्णन करता है।
Abstract
यह माइक्रोग्लिया के दोहरे दृश्य और माउस मस्तिष्क के ऊतकों में मैक्रोफेज घुसपैठ के लिए एक प्रोटोकॉल है। TMEM119 (जो microglia चुनिंदा लेबल), जब IBA1 के साथ संयुक्त (जो उनके आकृति विज्ञान के एक असाधारण दृश्य प्रदान करता है), घनत्व में परिवर्तन की जांच की अनुमति देता है, वितरण, और आकृति विज्ञान. इन मापदंडों को परिमाणित करना माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क के निवासी मैक्रोफेज द्वारा की गई भूमिकाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में महत्वपूर्ण है। सामान्य शारीरिक स्थितियों के तहत, microglia नियमित रूप से एक मोज़ेक की तरह पैटर्न में वितरित कर रहे हैं और ramified प्रक्रियाओं के साथ एक छोटा सा सोमा मौजूद है. फिर भी, पर्यावरणीय कारकों (यानी, आघात, संक्रमण, रोग, या चोट) के जवाब के रूप में, सूक्ष्म घनत्व, वितरण, और आकृति विज्ञान अपमान के आधार पर विभिन्न शिष्टाचार में बदल रहे हैं। इसके अतिरिक्त, वर्णित डबल दाग विधि आईबीए1 की उनकी अभिव्यक्ति के आधार पर और TMEM119 के साथ सहस्थानन के बिना मस्तिष्क में मैक्रोफेज घुसपैठ के दृश्य की अनुमति देता है। इस प्रकार यह दृष्टिकोण माइक्रोग्लिया और मैक्रोफेज में घुसपैठ के बीच भेदभाव की अनुमति देता है, जो स्वास्थ्य और रोग के विभिन्न संदर्भों में मस्तिष्क homeostasis में अपनी अलग भागीदारी में कार्यात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल neuroimmunoology में नवीनतम निष्कर्षों को एकीकृत करता है कि चयनात्मक मार्करों की पहचान से संबंधित है. यह भी दोनों अनुभवी neuroimmunoologists और परियोजनाओं में neuroimmunoology एकीकृत करने की मांग शोधकर्ताओं के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में कार्य करता है.
Introduction
तीव्र या पुरानी, neuroinflammation माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क के निवासी मैक्रोफेज से कसकर प्रभावित है या नहीं। इम्यूनोस्टेनिंग के माध्यम से माइक्रोग्लिया को दृश्यित करना प्रकाश माइक्रोस्कोपी, एक अत्यधिक सुलभ तकनीक के उपयोग के साथ न्यूरोसूजन के अध्ययन के लिए मूल्यवान है। homeostatic स्थितियों में, microglia आम तौर पर एक nonoverlapping, मोज़ेक की तरह पैटर्न में वितरित कर रहे हैं. वे छोटे सोमास प्रदर्शित करते हैं जो रामीकृतप्रक्रियाओं 1का विस्तार करते हैं , जो कभी – कभी एक दूसरे सेसंपर्क करते हैं 2. माइक्रोग्लियल रैम्ड प्रक्रियाओं गतिशील रूप से मस्तिष्क पैरेन्काइमा सर्वेक्षण, न्यूरॉन्स के साथ बातचीत, अन्य glial कोशिकाओं, और सामान्य शारीरिक स्थितियों के दौरान रक्त वाहिकाओं3. Microglia रिसेप्टर्स की एक शस्त्रागार है कि उन्हें प्रतिरक्षा कार्य करने के लिए और मस्तिष्क वातावरण में परिवर्तन का जवाब करने के लिए अनुमति देने के साथ सुसज्जित हैं, सेल मौत के लिए, या ऊतक क्षति के लिए. इसके अलावा, वे प्रमुख शारीरिक कार्यों, विशेष रूप से synaptic गठन, रखरखाव, और उन्मूलन4,5में लागू होते हैं.
माइक्रोग्लिया का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपलब्ध मार्करों में, आयनित कैल्शियम बाइंडिंग एडेप्टर अणु 1 (आईबीए1) सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले में से एक है। आईबीए1 एक कैल्शियम बाइंडिंग प्रोटीन है जो सूक्ष्मजीवी आकृति विज्ञान का असाधारण दृश्य प्रदान करता है, जिसमें सूक्ष्म विक्षिप्त प्रक्रियाएं शामिल हैं, जैसा कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी6द्वारा पुष्टि की गई है। यह उपकरण सूक्ष्म जीव परिवर्तन की विशेषता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, पूर्व में कहा जाता है “सक्रियण”, पशु रोग मॉडल7,8,9की एक विशाल सरणी में. neuroinflammation की उपस्थिति में, microglial प्रतिक्रिया में शामिल हैं: microgliosis कि सेलुलर घनत्व में वृद्धि के रूप में परिभाषित किया गया है, वितरण में परिवर्तन है कि कभी कभी क्लस्टरिंग में परिणाम, सेल शरीर की वृद्धि, साथ ही मोटाई और अधिक अमीबॉइड आकार के साथ संबद्ध प्रक्रियाओं का छोटा करना10,11,12,13.
इम्यूनोस्टेनिंग विशिष्ट मार्करों के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी की उपलब्धता द्वारा सीमित है। महत्वपूर्ण बात यह है कि आईबीए1 माइक्रोग्लिया द्वारा व्यक्त किया जाता है लेकिन यह भी परिधीय मैक्रोफेज द्वारा व्यक्त किया जाता है जो मस्तिष्क में घुसपैठकरते हैं 14. जबकि मस्तिष्क के अंदर आईबीए1-सकारात्मक कोशिकाओं का अवलोकन इस अनुसंधान क्षेत्र में माइक्रोग्लिया का एक मार्कर बन गया है, परिधीय मैक्रोफेज घुसपैठ विभिन्न परिस्थितियों में सूचित किया गया है, यहां तक कि स्वस्थ मस्तिष्क में मामूली15,16 ,17,18. नतीजतन, अकेले आईबीए1 का उपयोग माइक्रोग्लिया के चयनात्मक दृश्य की अनुमति नहीं देता है। इसके अतिरिक्त, मैक्रोफेज एक बार मस्तिष्क में घुसपैठ करने के बाद निवासी माइक्रोग्लिया की आणविक और आकृतिक विशेषताओं को अपनाते हैं, इस प्रकार भेदभावमेंबाधा डालते हैं। यह एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है जब दोनों microglia और मैक्रोफेज घुसपैठ के समारोह की जांच.
जबकि माइक्रोग्लिया और परिधीय मैक्रोफेज का मूल अलग होता है (उदाहरण के लिए, भ्रूणीय जर्दी थैली और अस्थि मज्जा से, क्रमशः20,21), निष्कर्षों की संख्या बढ़ती हुई है जो यह दर्शाता है कि दो कोशिका जनसंख्या एंगल करती है मस्तिष्क में विभिन्न भूमिकाओं19| इस प्रकार यह तरीकों कि इनवेसिव जोड़तोड़ के बिना इन दो आबादी के बीच भेदभाव का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है (यानी, अस्थि मज्जा chimeras या parabiosis) कि उनके घनत्व, वितरण, आकृति विज्ञान, और समारोह में बदल सकते हैं. TMEM119 स्वास्थ्य और रोग की स्थिति22भर में एक microglia-विशिष्ट मार्कर के रूप में उभरा है. जब IBA1 के साथ संयुक्त, इस मार्कर मैक्रोफेज, जो TMEM119-नकारात्मक और IBA1-सकारात्मक हैं घुसपैठ से इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोगी हो जाता है. हालांकि यह विकास विनियमित है, TMEM119 प्रसव के बाद के दिनों के रूप में जल्दी के रूप में व्यक्त किया है 3 (P3) और 6 (P6), तेजी से P10 और P1422के बीच वयस्क स्तर तक पहुँचने तक बढ़ रही है. आईबीए1 को भ्रूणीय दिन 10.5 (ई10.5)23के रूप में व्यक्त किया जाता है। इस प्रकार प्रस्तावित दोहरी लेबलिंग प्रोटोकॉल प्रसवोत्तर जीवन में इन दो आबादियों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है।
यह प्रोटोकॉल एक कदम दर कदम इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रिया प्रदान करता है जो माइक्रोग्लिया और परिधीय मैक्रोफेज के बीच भेदभाव की अनुमति देता है। इसमें यह भी बताया गया है कि सूक्ष्म-लघु घनत्व, वितरण और आकारिकी का मात्रात्मक विश्लेषण कैसे किया जाए, साथ ही परिधीय मैक्रोफेज घुसपैठ का विश्लेषण कैसे किया जाए। जबकि microglia और परिधीय मैक्रोफेज की जांच अपने आप उपयोगी है, इस प्रोटोकॉल आगे neuroinflammatory foyers के स्थानीयकरण की अनुमति देता है; इस प्रकार, यह भी विशिष्ट क्षेत्रों की पहचान करने के लिए पूरक (अभी तक, अधिक समय और संसाधन लेने वाली) तकनीकों के उपयोग के साथ, विशिष्ट क्षेत्रों की पहचान करने के लिए एक मंच के रूप में कार्य करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल दो महत्वपूर्ण भागों में विभाजित किया जा सकता है: धुंधला और विश्लेषण की गुणवत्ता. यदि धुंधला इष्टतम नहीं है, यह पर्याप्त रूप से microglial कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करने में विफल हो जाएगा, इस प्रका…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रयोगों के साथ उसके मार्गदर्शन और सहायता के लिए Nathali Vernoux के लिए आभारी हैं. हम भी Drs. Emmanuel Planel और सेर्गे Rivest उनके फ्लोरोसेंट और confocal माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए क्रमशः धन्यवाद करना चाहते हैं. यह काम आंशिक रूप से विज्ञान और प्रौद्योगिकी के मैक्सिकन परिषद (CONACYT; F.G.I करने के लिए), Fondation Famille-Choquette और केंद्र th$matik de recherche एन न्यूरोसाइंसेज (CTRN; K.P.), Fonds de Recherche du Qubec – Sant $ (M.B.) से छात्रवृत्ति द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और शास्त्री इंडो-कनाडा इंस्टीट्यूट (के.बी.) के साथ-साथ प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा की इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) से एम.ई.टी.एम.ई.टी. को डिस्कवरी ग्रांट स्वास्थ्य और चिकित्सा में न्यूरोम्यून्यून प्लास्टिकिटी का कनाडा रिसर्च चेयर (टियर II) रखती है।
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
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