マウス脳における微小グリア密度、形態および末梢骨髄細胞浸潤解析のためのIBA1およびTMEM119を用いた免疫蛍光染色
Summary
このプロトコルは、IBA1およびTMEM119の免疫蛍光コシャリンのための段階的なワークフローを記述し、ミクログリア密度、分布、および形態の分析に加えて、ならびにマウス脳組織における末梢骨髄細胞浸潤の分析を説明する。
Abstract
これは、ミクログリアの二重可視化とマウス脳組織におけるマクロファージへの浸潤のためのプロトコルである。TMEM119(ミクログリアに選択的にラベルを付ける)をIBA1(形態の例外的な可視化を提供する)と組み合わせることで、密度、分布、形態の変化を調査することができます。これらのパラメータを定量化することは、脳の常駐マクロファージであるミクログリアによって引き起こされる役割に関する洞察を提供する上で重要である。正常な生理学的条件下では、ミクログリアはモザイク状のパターンで定期的に分布し、ラミズプロセスを有する小さなソーマを提示する。それにもかかわらず、環境要因(すなわち、外傷、感染、疾患、または傷害)に対する応答として、微小グリア密度、分布、および形態は、侮辱に応じて様々な方法で変化する。さらに、記載された二重染色法は、IBA1の発現に基づいて脳内のマクロファージに浸潤し、TMEM119との共振を伴わずに可視化することを可能にする。このようにこのアプローチは、ミクログリアと浸潤マクロファージとの間の差別を可能にし、健康と疾患の様々な文脈にわたって脳恒常性に対する彼らの明確な関与に対する機能的な洞察を提供するために必要とされる。このプロトコルは、選択的マーカーの同定に関連する神経免疫学の最新の知見を統合する。また、経験豊富な神経免疫学者とプロジェクトに神経免疫学を統合しようとする研究者の両方のための有用なツールとして機能します。
Introduction
急性か慢性かにかかわらず、神経炎症はミクログリア、脳の常駐マクロファージによって密接に影響される。免疫染色を通じてミクログリアを可視化することは、光顕微鏡を用いた神経炎症の研究に役立つもので、非常にアクセスしやすい技術である。ホメオスタティック条件では、ミクログリアは通常、重なり合わないモザイク状のパターンで分布します。彼らは時々互いに接触する、ラミズされたプロセス1を拡張する小さなソマを示しています。微小グリアの突起プロセスは、正常な生理学的状態の間にニューロン、他のグリア細胞、および血管と相互作用する脳性毛腫を動的に調査する3。ミクログリアは、免疫学的タスクを実行し、脳のミリュー、細胞死、または組織損傷の変化に応答することを可能にする受容体の武器を備えています。加えて、それらは主要な生理学的機能を発揮し、特にシナプス形成、維持、および排除4、5で行う。
ミクログリアの研究に用いられる利用可能なマーカーの中でも、イオン化カルシウム結合アダプター分子1(IBA1)が最も広く用いられているものの1つである。IBA1は、電子顕微鏡6によって確認された微細遠位プロセスを含む微小グリア形態の例外的な可視化を提供するカルシウム結合タンパク質である。このツールは、以前は「活性化」と呼ばれていた微小グリア変換を、動物疾患モデル7、8、9の広大な配列で特徴付けるのに役立ちました。神経炎症の存在下で、微小グリア応答は、細胞密度の増加として定義される微小グリア症、時にはクラスタリング、細胞体の拡大、ならびに肥厚をもたらす分布の変化を含む。より多くのアメボイド形状10、11、12、13に関連するプロセスの短縮。
免疫染色は、特定のマーカーに対する抗体の入手可能性によって制限される。重要なことに、IBA1はミクログリアによって発現されるが、また脳14に浸潤する末梢マクロファージによって発現される。脳内のIBA1陽性細胞の観察は、この研究分野においてミクログリアのマーカーとなっているが、末梢マクロファージ浸潤は様々な条件下で報告されており、健康な脳15、16においてもわずかに 、17、18.したがって、IBA1単独の使用は、ミクログリアの選択的可視化を可能にしません。さらに、マクロファージは、いったん脳に侵入したミクログリアの分子的および形態学的特徴を採用し、したがって分化を妨げる19。これは、ミクログリアと浸潤マクロファージの両方の機能を調査する際の課題を表しています。
ミクログリアおよび末梢マクロファージは異なる起源を有するが(例えば、胚黄嚢および骨髄から、それぞれ20、21)、2つの細胞集団が発揮することを示す所見の数が増加している。脳内の異なる役割19.したがって、侵襲的な操作(すなわち、骨髄キメラまたはパラバイオシス)を伴わずに、密度、分布、形態、および機能を調節することができるこれらの2つの集団を区別する方法を使用することが重要です。TMEM119は、健康および疾患状態22にわたるミクログリア特異的マーカーとして出現した。IBA1と組み合わせると、このマーカーは、TMEM119陰性およびIBA1陽性である浸潤マクロファージからこれらの細胞を区別するのに有用となる。発達的に規制されている間、TMEM119は出生後3(P3)および6(P6)と早くも発現し、P10とP1422の間で成人レベルに達するまで着実に増加する。IBA1は胚の日10.5(E10.5)23と早くも表される。提案された二重標識プロトコルは、したがって、出生後の生活を通じてこれらの2つの集団を研究するのに有用である。
このプロトコルは、ミクログリアと末梢マクロファージ間の判別を可能にする段階的な免疫染色手順を提供する。また、ミクログリア密度、分布、形態の定量的分析や、末梢マクロファージ浸潤の解析を行う方法についても説明します。ミクログリアおよび末梢マクロファージの調査はそれ自体で有用であるが、このプロトコルはさらに神経炎症性ホワイエの局在化を可能にする。したがって、補完的な (まだ、より時間とリソースを消費する) 技術を使用して、調査する特定の領域を識別するプラットフォームとしても機能します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、染色と分析の品質という2つの重要な部分に分けることができます。染色が最適でない場合、マイクログリア細胞を適切に表現できず、密度、分布、および形態測定に影響を与えます。また、浸潤末末性骨髄細胞の割合は過小評価され得る。これは染色プロトコルの最適化されたバージョンですが、最適でない画像につながる可能性のあるいくつかの要因があります。動物…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ナタリー・ヴェルヌーの指導と実験への支援に感謝しています。また、エマニュエル・プラネル博士とセルジュ・リヴェスト博士の蛍光顕微鏡と共焦点顕微鏡の使用に感謝申し上げたい。この作品の一部は、メキシコ科学技術評議会(CONACYT;to F.G.I)、フォンダシオン・ファミーユ・チョケット、センター・テマティック・ド・レッシェルシュ・エン・ニューロサイエンス(CTRN;to K.P.)、フォン・ド・レッシェルシュ・デュ・ケベック-サンテ(M.B.)の奨学金によって資金提供されました。シャストリ・インド・カナダ研究所(K.B.へ)のほか、カナダ自然科学・工学研究評議会(NSERC)からM.E.T.M.E.T.へのディスカバリー・グラントは、カナダの健康と治療における神経可塑性の研究委員長(Tier II)を保有しています。
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
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