使用IBA1和TMEM119进行小鼠脑微胶质密度、形态学和周围骨髓细胞渗透分析的免疫荧光染色
Summary
该协议描述了IBA1和TMEM119免疫荧光结化的分步工作流程，除了分析微胶质密度、分布和形态，以及小鼠脑组织中外周髓细胞渗透。
Abstract
这是一种用于微胶质和渗透小鼠脑组织巨噬细胞的双重可视化的协议。TMEM119（选择性地标记微胶质），当与IBA1（提供其形态的异常可视化）相结合时，可以调查密度、分布和形态的变化。量化这些参数对于深入了解微胶体（大脑的常驻巨噬细胞）所扮演的角色非常重要。在正常生理条件下，微胶质定期以马赛克状模式分布，并呈现具有模压过程的小索马。然而，作为对环境因素（即创伤、感染、疾病或伤害）的反应，微胶质密度、分布和形态会以各种方式改变，具体取决于侮辱。此外，所述双染色方法允许根据其IBA1的表达，在不与TMEM119共定位的情况下，对大脑中渗透巨噬细胞进行可视化。因此，这种方法允许区分微胶质和渗透巨噬细胞，这是提供功能见解，使他们在健康和疾病的不同背景下对大脑平衡的独特参与。该协议集成了神经免疫学中与选择性标记物鉴定相关的最新发现。它还作为一个有用的工具，为有经验的神经免疫学家和研究人员寻求将神经免疫学纳入项目。
Introduction
无论是急性还是慢性，神经炎症都受到微胶质（大脑常住巨噬细胞）的严重影响。通过免疫染色可视化微胶质对于使用光显微镜（一种高度可访问的技术）研究神经炎症有价值。在静时条件下，微胶质通常以非重叠的马赛克状模式分布。他们表现出小索马，延长冲撞过程1，有时相互接触2。在正常生理条件下，微胶质电肿过程动态地测量脑气囊瘤，与神经元、其他胶质细胞和血管相互作用3。Microglia 配备了一个受体库，允许他们执行免疫学任务，并应对大脑环境的变化、细胞死亡或组织损伤。此外，它们还发挥关键的生理功能，特别是在突触形成、维持和消除4、5。
在用于研究微胶质的现有标记中，离子钙结合适配器分子1（IBA1）是使用最广泛的指标之一。IBA1是一种钙结合蛋白，提供微胶质形态的卓越可视化，包括精细的远端过程，电子显微镜6证实了这一点。该工具在描述微胶质转化（以前称为”活化”）方面起到了重要作用，在动物疾病模型7、8、9中。在神经炎症的存在，微胶质反应包括：微胶质症，定义为细胞密度增加，分布变化，有时导致聚类，细胞体扩大，以及增厚和缩短与更多ameboid形状相关的过程10，11，12，13。
免疫染色受针对特定标记物的抗体的可用性的限制。重要的是，IBA1是由微胶质表达的，但也由渗入大脑14的外围巨噬细胞表达。虽然观察脑内的IBA1阳性细胞已成为这一研究领域微胶质的标志，但周围巨噬细胞渗透在各种条件下被报道，甚至在健康大脑中略有渗透。 ，17，18.因此，单单使用IBA1并不能选择性地可视化微胶质。此外，巨噬细胞在渗入大脑后，采用居民微胶质的分子和形态特征，从而阻碍分化。这是一个挑战，当调查微胶质和渗透巨噬细胞的功能。
虽然微胶质和周围巨噬细胞有不同的起源（例如，从胚胎蛋黄囊和骨髓，分别20，21），有越来越多的发现表明，两个细胞群发挥不同的角色在大脑19。因此，使用无侵入性操作（即骨髓嵌合体或寄生虫）来区分这两个种群的方法至关重要，这些方法可以调节它们的密度、分布、形态和功能。TMEM119已成为一个微胶质特异性标记跨越健康和疾病条件22。当与IBA1结合使用时，该标记对于区分这些细胞与渗透巨噬细胞（TMEM119阴性和IBA1阳性）非常有用。虽然它是发育调节，TMEM119早在产后第3天（P3）和6（P6），稳步增加，直到达到P10和P1422之间的成人水平。IBA1最早表示在胚胎日10.5 （E10.5）23。因此，拟议的双标签方案有助于研究这两个种群的产后生活。
该协议提供了一个分步免疫染色程序，允许在微胶质和周围巨噬细胞之间进行区分。并解释了如何对微胶质密度、分布和形态进行定量分析，以及对周围巨噬菌体渗透的分析。虽然微胶质和周围巨噬细胞的调查本身是有用的，但该协议进一步允许神经炎门厅的本地化;因此，它还作为一个平台，利用补充（然而，更耗费时间和资源）技术，确定要调查的特定区域。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议可以分为两个关键部分：染色和分析的质量。如果染色不是最佳的，它将无法充分表示微胶质细胞，从而影响密度、分布和形态测量。此外，渗透周围骨髓细胞的比例可能被低估。这是染色协议的优化版本，但有几个因素可能会导致图像不理想。即使动物的灌注不包括在本协议中，但如果大脑固定没有很好地执行，染色的质量将受到损害。此外，需要足够的灌注，以确保血管内没有可能干?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢娜塔莉·韦尔努对实验的指导和协助。我们还要感谢伊曼纽尔·普朗内尔博士和谢尔盖·里夫斯特博士分别使用荧光显微镜和共聚焦显微镜。这项工作的部分经费来自墨西哥科学技术委员会（CONACYT;F.G.I）、法米尔-乔奎特基金会和神经科学研究中心（CTRN;K.P.）、魁北克基金会-圣地基金会（至医学硕士）的奖学金。Shastri Indo-Canada 研究所（至 K.B.），以及加拿大自然科学和工程研究委员会（NSERC）向 M.E.T.M.E.T.提供的发现补助金，担任加拿大健康与治疗神经免疫可塑性研究主席（第二级）。
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
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