인플루엔자 A 바이러스 감염 중 T 여포 도우미 세포 및 발아 센터 반응 평가
Summary
이 논문은 인플루엔자 바이러스 감염의 마우스 모형에 있는 Tfh 및 GC B 반응을 평가하는 프로토콜을 기술합니다.
Abstract
T 여포 도우미 (Tfh) 세포는 발아 센터 (GC) 개발 및 높은 친화도 항체의 생성에 대한 도움을 제공하는 데 전문화 된 독립적 인 CD4+ T 세포 하위 집합이다. 인플루엔자 바이러스 감염에서, 강력한 Tfh 및 GC B 세포 반응은 Tfh 관련 연구를 위한 자격을 갖춘 마우스 모형을 부여하는 효과적인 바이러스 박멸을 촉진하기 위하여 유도됩니다. 이 논문에서, 우리는 마우스에 있는 인플루엔자 바이러스 감염 도중 기본적인 Tfh 관련 면역 반응의 검출에 있는 프로토콜을 기술했습니다. 이러한 프로토콜포함: 인플루엔자 바이러스의 비강 내 접종; 폴리클론 및 항원 특이적 Tfh 세포, GC B 세포 및 혈장 세포의 유동 세포 피진 및 분석; GC의 면역 형광 검출; 혈청에서 인플루엔자 바이러스 특이적 항체의 효소-연결된 면역흡혈구 분석(ELISA). 이러한 분석체는 기본적으로 인플루엔자 바이러스 감염에서 Tfh 세포의 분화 및 기능을 정량화하여 분화 메커니즘 및 조작 전략을 해명하는 연구에 도움을 제공합니다.
Introduction
최근 10 년 동안, 수많은 연구는 새로 확인 된 CD4+ T 세포 서브 세트에 초점을 맞추고있다, Tfh 세포 하위 집합, 발아 센터 (GC) B 개발에 필수적인 역할에 대한. B세포 림프종 6(Bcl6)은 주로 유전자 억압자로 간주되는, Bcl6의 자궁외 발현이 Tfh 분화를 유도하기에 충분하다는 증거를 위해 Tfh 세포의 계보-정의 인자이며 Bcl6의 결핍으로 인해 Tfh 분화1,2,3이사라졌다. 다른 CD4+ T 도우미 서브세트가 염증 부위로 이동하여 이펙터 기능을 수행하는 것과 달리, Tfh 세포는 주로 비장 및 림프절의 B 세포 여포 영역에서 B 세포 도움을 제공한다. 공동 자극 분자 ICOS 및 CD40L, Tfh와 GC B 세포 사이의 상호 작용에 중요한 역할을한다. Tfh 분화 동안, ICOS는 코그네이트 B 세포로부터 필요한 신호를 전송하고 또한 B 세포 영역국소화4,5에대한 방관자 B 세포로부터 이동 신호를 수신 수용체 역할을한다. CD40L은 B 세포 증식 및 생존6을위한 Tfh 세포로부터의 신호 의 중재자이다. CD40L과 유사한 역할을 하는 또 다른 요인은 주로 Tfh 세포에 의해 분비되는 사이토카인 IL21이다. IL21은 GCB 세포의 개발 및 고친화항체의 생산을 직접 규제하지만 Tfh 분화에서의 역할은 여전히 논란의 여지가있는7,8. 현재 유동 세포 분석에서 Tfh 세포를 식별하는 데 가장 빈번하게 사용되는 PD-1 및 CXCR5는 이 하위 집합의 분화 및 기능에 중요한 역할을 합니다. CXCR5는 B 세포 여포 케모키인의 수용체이며 B 세포 여포9에서Tfh 세포의 국소화를 중재한다. PD-1은 이제 여포 유도 기능을 가질 뿐만 아니라 GC B 세포 친화 성숙 과정에서 중요한 신호를 전송하는 것으로 확인된다10. 이러한 사실 인정에 근거하여, 이 분자의 발현을 평가하는 것은 기본적으로 Tfh 세포의 성숙 그리고 기능을 반영할 수 있었습니다.
GC는 이차 림프구 기관에서 유도된 일시적인 미세 해부학 구조이며 Tfh 세포에 크게 의존하므로 Tfh 반응을 평가하기에 완벽한 판독값입니다. GC에서, 세포사화학 및 공동 자극 분자에 의해 매개되는 신호를 수신한 후, B 세포는고친화항체(11)를생성하기 위해 클래스 스위칭 및 체세포 초열의 대상이 된다. 차동 항체 클래스 스위칭은 INγ가 IgG2 급 스위칭12를유도하는 동안 IL4 및 IL21이 IgG1 급 스위칭을 유도하는 차동 사이토카인 틈새 시장에서 발생한다. 혈장 세포는 분비 항체의 생산자이며 말단 분화 세포입니다. Tfh 세포 같이, GC에 있는 B 세포의 발달은 많은 중요한 분자의 동적 발현과 연관됩니다. 현재 연구에 기초하여, GC B 세포는 B220+PNA+Fas+ 또는 B220+GL7+Fas+ 세포 및 혈장 세포로 식별 될 수있다, 자신의 전구체에 비해, B220의 표현을 다운 조절 및 UPregulate CD138 발현13. 더 구체적으로, 이들 특성은 유동 세포측정 및 면역형광 분석에서 검출될 수 있으므로 GC 반응의 적절한 평가가 된다.
강력한 세포 및 유머 반응은 인플루엔자 바이러스 감염에서 유도되며, Tfh 및 Th1 세포가 CD4+ T 세포 반응14를지배하여 Tfh 세포 분화 연구를위한 완벽한 모델입니다. 인플루엔자 A/푸에르토리코/8/34 H1N1(PR8)은 일반적으로 사용되는 마우스 적응 균주이며, 이 연구에서 자주 사용된다14,15,16. 여기에서, 우리는 인플루엔자 바이러스 감염에 있는 Tfh 연구 관련 분석의 몇몇 기본적인 프로토콜을 기술합니다: 1) PR8 바이러스의 비강 내 접종; 2) 항원 특이적 Tfh 세포, GC B 및 혈장 세포 및 유동 세포측정을 갖는 IL21 검출; 3) GC의 조직학적 시각화; 4) ELISA와 혈청에서 항원 특이적 항체 티터의 검출. 이 프로토콜은 Tfh 관련 연구 결과에 있는 새로운 연구원을 위한 필요한 기술을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
높은 친화성 항체를 생성하기 위한 B 세포 도움을 제공하는 전문화한 역할 때문에 Tfh 세포는 백신 설계를 위한 새로운 전략을 제공하기 위하여 분화 및 조작의 기계장치에서 광범위하게 공부되었습니다. 인플루엔자 바이러스 감염은 활발한 Tfh 및 GC B 세포 반응을 유도하여 이 연구 분야에 적합한 모델이 됩니다. 본 논문에서, 우리는 비강 내 접종에 의한 인플루엔자 바이러스 감염의 프로토콜을 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 흐름 세포측정 시설, ABSL2 시설 및 상하이 의 SPF 동물 시설의 직원들이 기술적 인 도움과 조언을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 중국 과학 아카데미 (XDB29030103), 중국 국립 핵심 R & D 프로그램 (2016YFA0502202), 중국 국립 자연 과학 재단 (31570886)의 전략적 우선 순위 연구 프로그램에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
- Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
- Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
- Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
- Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
- Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
- Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
- Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
- Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
- Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
- Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
- Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495 (2014).
- He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
- León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
- Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
- Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
- Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
- Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).
