小鼠感染甲型流感病毒期间T卵泡帮助细胞和胚芽中心反应的评价
Summary
本文描述了在流感病毒感染小鼠模型中评估Tfh和GC B反应的协议。
Abstract
T 卵泡帮助器 （Tfh） 细胞是一个独立的 CD4+ T 细胞子集，专门为细菌中心 （GC） 的发育和高亲和力抗体的生成提供帮助。在流感病毒感染中，诱导强大的Tfh和GC B细胞反应，以促进有效的病毒根除，这为Tfh相关研究提供了合格的鼠标模型。在本文中，我们描述了在小鼠感染流感病毒期间检测与Tfh相关的基本免疫反应的协议。这些协议包括：流感病毒的鼻内接种：流细胞染色和多克隆和抗原特异性Tfh细胞、GC B细胞和血浆细胞的分析：GC的免疫荧光检测;血清中流感病毒特异性抗体的酶相关免疫体检测（ELISA）。这些检测方法基本量化了Tfh细胞在流感病毒感染中的分化和功能，从而有助于研究区分机制和操作策略。
Introduction
近十年来，许多研究都集中在新发现的CD4+T细胞子集Tfh细胞子集上，因为它在胚芽中心（GC）B发育中的重要作用。B细胞淋巴瘤6（Bcl6），主要被认为是一种基因抑制剂，是Tfh细胞的血统定义因子，以证明Bcl6的异位表达足以驱动Tfh分化，而Bcl6的缺乏导致Tfh分化1，2，3消失。与其他CD4+T助剂子集通过迁移到炎症部位来发挥其作用或功能不同，Tfh细胞主要在脾脏和淋巴结的B细胞卵泡区提供B细胞帮助。共刺激分子 ICOS 和 CD40L 在 Tfh 和 GC B 细胞之间的相互作用中起着重要作用。在Tfh分化过程中，ICOS从认知B细胞传输必要的信号，并充当接收来自旁观者B细胞的迁移信号的受体，用于B细胞区域定位4、5。CD40L是来自Tfh细胞的信号的调停器，用于B细胞增殖和生存6。与CD40L扮演类似角色的另一个因素是细胞因子IL21，它主要由Tfh细胞分泌。IL21直接调节GC B细胞的高亲和力抗体的开发和生产，但它在Tfh分化中的作用仍有争议。PD-1 和 CXCR5 现在最常用于识别流细胞学分析中的 Tfh 细胞，它们也在这个子集的分化和功能中发挥着重要作用。CXCR5是B细胞卵泡化学素的受体，并调解Tbh细胞在B细胞卵泡9的本地化。PD-1现已确定不仅具有卵泡导引功能，而且在GC B细胞亲和力成熟10的过程中传输临界信号。基于这些发现，评估这些分子的表达基本上可以反映Tfh细胞的成熟和功能。
GC 是继发淋巴器官中的诱导瞬态微解剖结构，高度依赖 Tfh 细胞，因此是评估 Tfh 反应的完美读出。在GC中，在接收细胞因子和共刺激分子调停的信号后，B细胞受到类开关和体细胞多造，以产生高亲和力抗体11。差异抗体类切换发生在差异细胞因子利基，其中IL4和IL21诱导IgG1类切换，而IFNγ诱导IgG2类开关12。等离子体细胞是分泌抗体的产生者，是最终分化的细胞。与Tfh细胞一样，GC中B细胞的发展与许多重要分子的动态表达有关。根据目前的研究，GC B细胞可以识别为B220+PNA+Fas+或B220+GL7+Fas+细胞和等离子体细胞，与其前体相比，B220的低调节表达和向上调节CD138表达13。此外，这两种特征都可以在流动细胞学和免疫荧光分析中检测出来，从而对GC反应进行适当的评估。
在流感病毒感染中诱导强大的细胞和幽默反应，Tfh和Th1细胞主导CD4+T细胞反应14，这使得它成为Tfh细胞分化研究的完美模型。甲型流感/波多黎各/8/34 H1N1（PR8），这是一种常用的适应鼠标的菌株，在这项研究中经常使用14，15，16。在这里，我们描述了流感病毒感染中Tfh研究相关检测的一些基本方案：1）PR8病毒的鼻内接种：2） 抗原特异性Tfh细胞、GC B和血浆细胞以及IL21检测与流细胞学：3） GC的组织学可视化：4） 检测抗原特异性抗体滴度在血清与 ELISA.这些协议为与Tfh相关的研究中的新研究人员提供了必要的技术。
Protocol
Representative Results
Discussion
由于在提供B细胞帮助产生高亲和力抗体方面具有特殊作用，Tbh细胞在分化和操纵机制方面进行了广泛的研究，为疫苗设计提供了新的策略。流感病毒感染诱发强大的Tfh和GC B细胞反应，因此是这一研究领域的一个适当模型。本文通过鼻内接种、流细胞学、免疫荧光和ELISA对Tfh相关反应的评价，描述了流感病毒感染的治疗方案。这些检测将有助于检测Tfh分化、GC B发育和流感病毒特异性抗体，并帮助?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢上海巴斯德医院流动细胞学设施、ABSL2设施和SPF动物设施的工作人员提供的技术帮助和建议。这项工作得到了以下资助：中国科学院战略重点研究计划（XDB29030103）、中国国家重点研发计划（2016YFA0502202）、中国国家自然科学基金委员会（31570886）。
Materials
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
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