Valutazione delle cellule di aiuto follicolare T e della risposta del centro germinale durante l'infezione da virus influenzale A nei topi
Summary
Questo documento descrive i protocolli di valutazione della risposta Tfh e GC B nel modello di topo di infezione da virus influenzale.
Abstract
Le cellule T Follicular Helper (Tfh) sono un sottoinsieme indipendente di cellule CD4+ T specializzato nel fornire aiuto per lo sviluppo del centro germinale (GC) e la generazione di anticorpi ad alta affinità. Nell’infezione da virus influenzale, le risposte robuste delle cellule Tfh e GC B sono indotte a facilitare un’efficace eradicazione del virus, che conferisce un modello di topo qualificato per lo studio associato a Tfh. In questo documento, abbiamo descritto i protocolli nel rilevamento della risposta immunitaria associata a Tfh di base durante l’infezione da virus influenzale nei topi. Questi protocolli includono: inoculazione intranasale del virus influenzale; colorazione citometrica a flusso e analisi di cellule Tfh policlonali e antigene specifiche, cellule GC B e cellule plasmatiche; individuazione dell’immunofluorescenza dei TC; saggio immunoassorbente legato all’enzima (ELISA) dell’anticorpo specifico del virus influenzale nel siero. Questi test quantificano fondamentalmente la differenziazione e la funzione delle cellule Tfh nell’infezione da virus influenzale, fornendo così aiuto per studi nel meccanismo di differenziazione e nella strategia di manipolazione.
Introduction
Nell’ultimo decennio, numerosi studi si sono concentrati sul sottoinsieme di cellule CD4+ T appena identificato, sottoinsieme cellulare Tfh, per i suoi ruoli essenziali nello sviluppo del centro germinale (GC) B. Il linfoma a cellule B 6 (Bcl6), che è principalmente considerato come repressore genico, è il fattore che definisce il lignaggio delle cellule Tfh per la prova che l’espressione ectopica di Bcl6 è sufficiente per guidare la differenziazione Tfh mentre la carenza di Bcl6 si traduce in una differenziazione Tfhscomparsa 1,2,3. A differenza di altri sottoinsiemi di helper CD4+ T che eseguono la loro funzione di effettore tramite migrazione verso i siti di infiammazione, le cellule Tfh forniscono l’aiuto della cellula B principalmente nella zona follicolare delle cellule B di milza e linfonodo. Le molecole co-stimolanti ICOS e CD40L, svolgono un ruolo significativo nell’interazione tra cellule Tfh e GC B. Durante la differenziazione Tfh, L’ICOS trasmette i segnali necessari dalle cellule B affini e agisce anche come recettore che riceve segnali di migrazione da cellule B passanti per la localizzazione della zona cellulare B4,5. CD40L è un mediatore di segnali provenienti dalle cellule Tfh per la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule B6. Un altro fattore che gioca il ruolo simile a CD40L è la citochina IL21, che è principalmente secreta dalle cellule Tfh. IL21 regola direttamente lo sviluppo e la produzione di cellule GC B di anticorpi ad alta affinità, ma il suo ruolo nella differenziazione Tfh èancora controverso 7,8. Pd-1 e CXCR5, che sono ora più frequentemente utilizzati nell’identificazione delle cellule Tfh nell’analisi della citometria del flusso, svolgono anche ruoli significativi nella differenziazione e nella funzione di questo sottoinsieme. CXCR5 è il recettore della chemiochina follicolare cellulare B e media la localizzazione delle cellule Tfh nei follicoli cellulari B9. Pd-1 è ora identificato non solo per avere la funzione di guida follicolare, ma anche trasmettere segnali critici nel processo di maturazione dell’affinità delle cellule GC B10. Sulla base di questi risultati, valutare l’espressione di queste molecole potrebbe fondamentalmente riflettere la maturazione e la funzione delle cellule Tfh.
Il GC è una struttura microanatomica transitoria indotta negli organi linfoidi secondari e altamente dipendente dalle cellule Tfh, essendo così una lettura perfetta per valutare la risposta di Tfh. In GC, dopo aver ricevuto segnali mediati da citochine e molecole co-stimolanti, le cellule B sono soggette a commutazione di classe e ipermutazione somatica per generare anticorpi adalta affinità 11. La commutazione differenziale della classe di anticorpi avviene nella nicchia differenziale della citochina, in cui IL4 e IL21 inducono la commutazione di classe IgG1 mentre IFNγ induce la commutazione di classe IgG212. Le cellule plasmatiche sono i produttori di anticorpi secreti e sono cellule differenziate terminalemente. Come le cellule Tfh, lo sviluppo di cellule B in GC è associato all’espressione dinamica di molte molecole significative. Sulla base dello studio attuale, le cellule GC B possono essere identificate come cellule B220+PNA+Fas+ o B220+GL7+Fas+ e cellule plasmatiche, rispetto ai loro precursori, espressione di downregolato di B220 e upregolazione espressione CD13813. Inoltre, entrambe queste caratteristiche possono essere rilevate nella citometria del flusso e nell’analisi dell’immunofluorescenza, essendo quindi un’adeguata valutazione della risposta gc.
Risposte cellulari e umoriali robuste sono indotte nell’infezione da virus influenzale, con cellule Tfh e Th1 che dominano la risposta cellulare CD4+ T14, il che lo rende un modello perfetto per lo studio di differenziazione delle cellule Tfh. Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), che è un ceppo comunemente usato adattato al topo, è frequentemente usato in questostudio 14,15,16. Qui descriviamo alcuni protocolli di base del saggio Tfh rilevante per lo studio nell’infezione da virus influenzale: 1) inoculazione intranasale del virus PR8; 2) cellule Tfh specifiche dell’antigene, cellule GC B e plasma e rilevamento IL21 con citometria a flusso; 3) visualizzazione istologica del GC; 4) rilevazione di formicolio anticorpale specifico dell’antigene nel siero con ELISA. Questi protocolli forniscono le tecniche necessarie per i nuovi ricercatori nello studio associato a Tfh.
Protocol
Representative Results
Discussion
A causa di ruoli specializzati nel fornire aiuto alle cellule B per generare anticorpi ad alta affinità, le cellule Tfh sono state ampiamente studiate nei meccanismi di differenziazione e manipolazione per fornire nuove strategie per la progettazione dei vaccini. L’infezione da virus influenzale induce vigorose risposte alle cellule Tfh e GC B, essendo così un modello appropriato per questo campo di ricerca. In questo documento, abbiamo descritto i protocolli di infezione da virus influenzale per inoculazione intranasa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il personale della struttura di citometria a flusso, della struttura ABSL2 e della struttura per animali SPF dell’Institut Pasteur di Shanghai per il loro aiuto tecnico e consulenza. Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni: Strategic Priority Research Program della Chinese Academy of Sciences (XDB29030103), National Key R&D Program of China (2016YFA0502202), National Natural Science Foundation of China (31570886).
Materials
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
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