マウスにおけるインフルエンザAウイルス感染時のT濾胞ヘルパー細胞と胚葉センター応答の評価
Summary
本論文では、インフルエンザウイルス感染のマウスモデルにおけるTfhおよびGC B応答を評価するプロトコルについて説明する。
Abstract
T濾胞ヘルパー(Tfh)細胞は、生殖中心(GC)の開発および高親和性抗体の生成に関する助けを提供することに特化した独立したCD4+T細胞サブセットです。インフルエンザウイルス感染では、強力なTfhおよびGC B細胞応答が誘導され、効果的なウイルス根絶を促進し、Tfh関連研究のための適格なマウスモデルを与える。本論文では、マウスにおけるインフルエンザウイルス感染時のTfh関連免疫応答の基本的な検出におけるプロトコルについて述べた。これらのプロトコルは、含まれます: インフルエンザウイルスの鼻内接種;フローサイトメトリー染色とポリクローナルおよび抗原特異的Tfh細胞の分析, GC B細胞および形質細胞;GCの免疫蛍光検出;血清中のインフルエンザウイルス特異的抗体の酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)これらのアッセイは、基本的にインフルエンザウイルス感染におけるTfh細胞の分化と機能を定量化し、分化メカニズムおよび操作戦略の解明に関する研究に役立つ。
Introduction
最近の10年間、新たに同定されたCD4+T細胞サブセット、Tfh細胞サブセットに多数の研究が焦点を当てられており、胚中心(GC)Bの開発におけるその本質的な役割について。B細胞リンパ腫6(Bcl6)は、主に遺伝子リプレッサーと考えられているが、Bcl6の異所性発現がTfh分化を促進するのに十分であるという証拠に対するTfh細胞の系統定義因子であり、Bcl6の欠乏は消失したTfh分化1、2、3をもたらす。炎症部位への移行によってエフェクター機能を実行する他のCD4+Tヘルパーサブセットとは異なり、Tfh細胞は、主に脾臓およびリンパ節のB細胞濾胞帯においてB細胞の助けを提供する。共刺激分子ICOSとCD40Lは、TfhとGC B細胞との相互作用において重要な役割を果たす。Tfh分化の間、ICOSは、同結合B細胞から必要なシグナルを伝達し、B細胞ゾーン局在4,5に対する傍観者B細胞からの移行シグナルを受け取る受容体としても機能する。CD40Lは、B細胞の増殖および生存のためのTfh細胞からのシグナルのメディターである6.CD40Lと同様の役割を果たすもう一つの要因は、主にTfh細胞によって分泌されるサイトカインIL21である。IL21はGC B細胞の高親和性抗体の開発と産生を直接調節するが、Tfh分化におけるその役割は依然として議論の余地がある7,8である。現在、フローサイトメトリー分析でTfh細胞を同定する際に最も頻繁に使用されているPD-1およびCXCR5は、このサブセットの分化と機能においても重要な役割を果たしています。CXCR5は、B細胞濾胞ケモカインの受容体であり、B細胞卵胞9におけるTfh細胞の局在化を媒介する。PD-1は、濾胞誘導機能を有するだけでなく、GCB細胞親和性成熟10の過程で臨界信号を伝達することも同定された。これらの知見に基づいて、これらの分子の発現を評価することは、基本的にTfh細胞の成熟および機能を反映することができる。
GCは、二次リンパ器官における誘導過渡的な微小解剖学的構造であり、Tfh細胞に非常に依存し、Tfh応答を評価するのに最適な読み出しである。GCにおいて、サイトカインおよび共刺激分子によって媒介される信号を受信した後、B細胞はクラススイッチングおよび体細胞ハイパー突然変異を受けて高親和性抗体11を生成する。差動抗体クラス切り替えは、微分サイトカインニッチで起こり、IL4およびIL21はIgG1クラス切換を誘導し、IFNγはIgG2クラススイッチング12を誘導する。形質細胞は分泌された抗体の生産者であり、末端分化細胞である。Tfh細胞と同様に、GCにおけるB細胞の発達は、多くの重要な分子の動的発現と関連している。現在の研究に基づいて、GC B細胞はB220+PNA+Fas+またはB220+GL7+Fas+Fas+細胞および形質細胞と同定することができ、その前駆体と比較して、B220の発現を下方調節し、CD138発現13をアップコンジェクツする。さらに、これらの特性の両方をフローサイトメトリーおよび免疫蛍光分析において検出することができ、よってGC応答の適切な評価が行われる。
強い細胞および体液性応答は、インフルエンザウイルス感染において誘導され、TfhおよびTh1細胞がCD4+ T細胞応答を支配し、Tfh細胞分化研究に最適なモデルとなる。インフルエンザA/プエルトリコ/8/34 H1N1(PR8)は、一般的に使用されるマウス適応株であり、この研究では14、15、16によく使用される。ここでは、インフルエンザウイルス感染におけるTfh研究関連アッセイの基本的なプロトコルについて説明します: 1) PR8ウイルスの鼻腔内接種;2)抗原特異的Tfh細胞、GC Bおよび形質細胞およびIL21検出とフローサイトメトリーを用いた;3) GCの組織学的可視化;4)ELISAによる血清中の抗原特異的抗体抗体の検出。これらのプロトコルは、Tfh関連研究の新しい研究者に必要な技術を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
高親和性抗体を生成するためのB細胞の助けを提供する上で専門的な役割を果たしているため、Tfh細胞はワクチン設計のための新しい戦略を提供するために分化および操作のメカニズムにおいて広範囲に研究されてきた。インフルエンザウイルス感染は、TfhおよびGC B細胞の応答を活発に誘導し、この分野の研究に適したモデルとなる。本論文では、鼻腔内接種によるインフルエンザウイルス?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
上海のパスツール研究所のフローサイトメトリー施設、ABSL2施設、SPF動物施設のスタッフの皆様に、技術的なアドバイスとアドバイスをいただき、ありがとうございました。この研究は、中国科学アカデミーの戦略的優先研究プログラム(XDB29030103)、中国国家キーR&Dプログラム(2016YFA0502202)、中国国立自然科学財団(31570886)によって支えられました。
Materials
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
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