Evaluación de las células auxiliares foliculares T y la respuesta del centro germinal durante la infección por el virus de la gripe A en ratones
Summary
Este documento describe los protocolos de evaluación de la respuesta Tfh y GC B en el modelo de ratón de infección por el virus de la gripe.
Abstract
Las células T Follicular Helper (Tfh) son un subconjunto independiente de células CD4+ T especializado en proporcionar ayuda para el desarrollo del centro germinal (GC) y la generación de anticuerpos de alta afinidad. En la infección por el virus de la gripe, se inducen respuestas sólidas de células Tfh y GC B para facilitar la erradicación eficaz del virus, lo que confiere un modelo de ratón cualificado para el estudio asociado a Tfh. En este artículo, describimos protocolos en la detección de la respuesta inmune básica asociada a Tfh durante la infección por el virus de la gripe en ratones. Estos protocolos incluyen: inoculación intranasal del virus de la gripe; flujo de tinción de citometría y análisis de células Tfh policlonales y específicas de antígenos, células GC B y células plasmáticas; detección de inmunofluorescencia de GCs; ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA) de anticuerpos específicos del virus de la gripe en suero. Estos ensayos básicamente cuantifican la diferenciación y la función de las células Tfh en la infección por el virus de la gripe, proporcionando así ayuda para estudios sobre el mecanismo de diferenciación y estrategia de manipulación.
Introduction
En la última década, numerosos estudios se han centrado en el subconjunto de células CD4+ T recientemente identificado, subconjunto de células Tfh, por sus funciones esenciales en el desarrollo del centro germinal (GC) B. El linfoma de células B 6 (Bcl6), que se considera principalmente como represor genético, es el factor definitorio del linaje de las células Tfh para la evidencia de que la expresión ectopic de Bcl6 es suficiente para impulsar la diferenciación tfh, mientras que la deficiencia de Bcl6 resulta en la diferenciación tfh desaparecida1,2,3. A diferencia de otros subconjuntos auxiliares CD4+ T que realizan su función de efector mediante la migración a los sitios de inflamación, las células Tfh proporcionan la ayuda celular B principalmente en la zona folicular de células B de bazo y ganglio linfático. Las moléculas co-estimulantes ICOS y CD40L, desempeñan un papel significativo en la interacción entre las células Tfh y GC B. Durante la diferenciación tfh, ICOS transmite las señales necesarias de las células B del cognato y también actúa como un receptor que recibe señales de migración de las células B del transeúnte para la localización de la zona celular B4,5. CD40L es un mediador de señales de células Tfh para la proliferación de células B y supervivencia6. Otro factor que juega el papel similar a CD40L es la citoquina IL21, que es secreta principalmente por las células Tfh. IL21 regula directamente el desarrollo de células GC B y la producción de anticuerpos de alta afinidad, pero su papel en la diferenciación de Tfh sigue siendo controvertido7,8. PD-1 y CXCR5, que ahora se utilizan con mayor frecuencia en la identificación de células Tfh en el análisis de citometría de flujo, también desempeñan un papel significativo en la diferenciación y función de este subconjunto. CXCR5 es el receptor de la quimiocina folicular de células B y media la localización de células Tfh en folículos celulares B9. Pd-1 ahora se identifica no sólo para tener la función de orientación folicular, sino también transmitir señales críticas en el proceso de maduración de afinidad de células GC B10. Sobre la base de estos hallazgos, evaluar la expresión de estas moléculas podría básicamente reflejar la maduración y la función de las células Tfh.
El GC es una estructura microanatomical transitoria inducida en órganos linfoides secundarios y altamente dependiente de las células Tfh, siendo así una lectura perfecta para evaluar la respuesta de Tfh. En GC, después de recibir señales mediadas por citoquinas y moléculas co-estimulantes, las células B están sujetas a conmutación de clases e hipermutación somática para generar anticuerpos de alta afinidad11. La conmutación diferencial de la clase de anticuerpos se produce en el nicho diferencial de citoquinas, en el que IL4 e IL21 inducen la conmutación de la clase IgG1 mientras que el IFNḥ induce el cambio de clase IgG212. Las células plasmáticas son los productores de anticuerpos secretos y son células diferenciadas terminalmente. Al igual que las células Tfh, el desarrollo de células B en GC se asocia con la expresión dinámica de muchas moléculas significativas. Según el estudio actual, las células GC B se pueden identificar como B220+PNA+Fas+ o B220+GL7+Fas+ células y células plasmáticas, en comparación con sus precursores, expresión downregulate de B220 y cd138 upregulate expresión133. Además, ambas características se pueden detectar en el análisis de citometría de flujo e inmunofluorescencia, siendo así una evaluación adecuada de la respuesta de GC.
Respuestas celulares y humorales robustas son inducidas en la infección por el virus de la gripe, con células Tfh y Th1 dominando CD4+ T respuesta celular14,lo que lo convierte en un modelo perfecto para el estudio de diferenciación de células Tfh. Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), que es una cepa adaptada al ratón de uso común, se utiliza con frecuencia en este estudio14,15,16. Aquí, describimos algunos protocolos básicos del ensayo relevante para el estudio de Tfh en la infección por el virus de la gripe: 1) inoculación intranasal del virus PR8; 2) células Tfh específicas de antígenos, células GC B y plasma y detección IL21 con citometría de flujo; 3) visualización histológica de GC; 4) detección de titer de anticuerpos específicos de antígenos en suero con ELISA. Estos protocolos proporcionan las técnicas necesarias para nuevos investigadores en el estudio asociado a Tfh.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debido a los roles especializados en proporcionar ayuda de células B para generar anticuerpos de alta afinidad, las células Tfh han sido ampliamente estudiadas en los mecanismos de diferenciación y manipulación para proporcionar nuevas estrategias para el diseño de vacunas. La infección por el virus de la gripe induce vigorosas respuestas de las células Tfh y GC B, siendo así un modelo adecuado para este campo de investigación. En este documento, describimos protocolos de infección por el virus de la gripe por …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al personal de las instalaciones de citometría de flujo, las instalaciones de ABSL2 y las instalaciones de animales SPF del Institut Pasteur de Shanghai por su ayuda técnica y asesoramiento. Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: Programa de Investigación Estratégica Prioritaria de la Academia China de Ciencias (XDB29030103), Programa Nacional clave de I+D de China (2016YFA0502202), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31570886).
Materials
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
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