Utvärdering av T Follicular Helper Celler och Germinal Center Svar under influensa A Virusinfektion hos möss
Summary
Detta dokument beskriver protokoll för utvärdering av Tfh och GC B svar i mus modell av influensa virus infektion.
Abstract
T Follicular Helper (Tfh) celler är en oberoende CD4+ T cell delmängd som specialiserat sig på att ge hjälp för germinal center (GC) utveckling och generering av hög affinitet antikroppar. Vid influensavirusinfektion induceras robusta Tfh- och GC B-cellsvar för att underlätta effektiv virusutrotning, vilket ger en kvalificerad musmodell för Tfh-associerade studier. I detta dokument beskrev vi protokoll för påvisande av grundläggande Tfh-associerade immunsvar under influensa virus infektion hos möss. Dessa protokoll omfattar intranasal inokulering av influensavirus; Flödescytometrifärgning och analys av polyklonala och antigenspecifika Tfh-celler, GC B-celler och plasmaceller. Immunofluorescens detektion av GCs. enzym-linked immunosorbent analys (ELISA) av influensa virus-specifika antikroppar i serum. Dessa analyser kvantifierar i princip differentiering och funktion av Tfh-celler vid influensavirusinfektion, vilket ger hjälp till studier för att belysa differentieringsmekanism och manipulationsstrategi.
Introduction
Under det senaste decenniet har många studier fokuserats på den nyligen identifierade CD4+ T-cellundergruppen Tfh cell delmängd, för dess väsentliga roller i germinal center (GC) B utveckling. B-cellslymfom 6 (Bcl6), som främst betraktas som en genrepressor, är den härstamningsdefinierande faktorn hos Tfh-celler för bevis för att utomkvedsuttryck av Bcl6 är tillräckligt för att driva Tfh differentiering medan brist på Bcl6 resulterar i försvunnen Tfh differentiering1,2,3. Till skillnad från andra CD4+ T-hjälpgrupper som utför sin effektorfunktion genom migrering till inflammationsplatserna, ger Tfh-celler B-cellhjälpen främst i B-cellens follikulära zon av mjälte och lymfkörtel. Medstimulerande molekyler ICOS och CD40L spelar betydande roller i interaktionen mellan Tfh- och GC B-celler. Under Tfh-differentiering överför ICOS nödvändiga signaler från konjak B-celler och fungerar också som en receptor som tar emot migrationssignaler från B-celler för B-cellzonlokalisering4,5. CD40L är en medlare av signaler från Tfh-celler för B-cellers spridning och överlevnad6. En annan faktor som spelar en liknande roll som CD40L är cytokinen IL21, som huvudsakligen utsöndras av Tfh-celler. IL21 reglerar direkt GC B-cellers utveckling och produktion av hög affinitetsantikroppar, men dess roll i Tfh-differentiering är fortfarande kontroversiell7,8. PD-1 och CXCR5, som nu oftast används för att identifiera Tfh-celler i flödescytometrianalys, spelar också betydande roller i differentiering och funktion av denna delmängd. CXCR5 är receptorn för B-cells follikulärt chemokin och förmedlar lokaliseringen av Tfh-celler i B-cellsäckar9. PD-1 identifieras nu för att inte bara ha follikulära styrfunktionen utan också överföra kritiska signaler i processen med GC B-celler affinitet mognad10. Baserat på dessa resultat kan utvärdering av uttrycket av dessa molekyler i princip återspegla mognaden och funktionen hos Tfh-celler.
GC är en inducerad transienta mikroanatomical struktur i sekundära lymfoida organ och mycket beroende av Tfh celler, vilket är en perfekt avläsning för att utvärdera Tfh svar. I GC, efter att ha fått signaler medierade av cytokiner och samstimulerande molekyler, är B-celler föremål för klassväxling och somatisk hypermutation för att generera antikroppar med hög affinitet11. Differentiell antikroppsklassväxling sker i differentialcytokinnisch, där IL4 och IL21 inducerar IgG1-klassväxling medan IFNγ inducerar IgG2-klassbyte12. Plasmaceller är producenter av utsöndrade antikroppar och är terminalt differentierade celler. Liksom Tfh-celler är utveckling av B-celler i GC förknippad med dynamiskt uttryck av många signifikanta molekyler. Baserat på den aktuella studien kan GC B-celler identifieras som B220+PNA+Fas+ eller B220+GL7+Fas+ celler och plasmaceller, jämfört med deras prekursorer, nedreglerat uttryck av B220 och uppreglerat CD138-uttryck13. Dessutom kan båda dessa egenskaper detekteras i flödescytometri och immunofluorescensanalys, vilket är lämplig utvärdering av GC-svar.
Robusta cellulära och humorala svar induceras vid influensavirusinfektion, där Tfh- och Th1-celler dominerar CD4+ T-cellsrespons14, vilket gör det till en perfekt modell för Tfh-cellers differentieringsstudie. Influensa A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), som är en vanlig musanpassad stam, används ofta i denna studie14,15,16. Här beskriver vi några grundläggande protokoll för Tfh studierelevant analys vid influensavirusinfektion: 1) intranasal inokulering av PR8-virus; 2) Antigenspecifika Tfh-celler, GC B- och plasmaceller och IL21-detektion med flödescytometri. 3) histologisk visualisering av GC; 4) påvisande av antigenspecifik antikroppstiter i serum med ELISA. Dessa protokoll ger de nödvändiga teknikerna för nya forskare i Tfh-associerade studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund av specialiserade roller i att ge B-cellshjälp för att generera hög affinitetsantikroppar har Tfh-celler studerats utförligt i mekanismerna för differentiering och manipulation för att tillhandahålla nya strategier för vaccindesign. Influensavirusinfektion inducerar kraftfulla Tfh- och GC B-cellers svar, vilket är en lämplig modell för detta forskningsområde. I detta dokument beskrev vi protokoll av influensa virus infektion genom intranasal inokulering, utvärdering av Tfh-associerade svar av flöd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar personalen vid flödescytometrianläggningen, ABSL2-anläggningen och SPF:s djuranläggning vid Institut Pasteur i Shanghai för deras tekniska hjälp och råd. Detta arbete stöddes av följande bidrag: Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences (XDB29030103), National Key FoU Program of China (2016YFA0502202), National Natural Science Foundation of China (31570886).
Materials
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
- Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
- Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
- Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
- Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
- Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
- Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
- Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
- Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
- Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
- Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
- Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495 (2014).
- He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
- León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
- Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
- Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
- Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
- Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).
