Een kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebaseerde enkelvoudige liposoom test voor het opsporen van de compositorische Inhomogeniteit tussen individuele liposomen
Summary
Dit protocol beschrijft de fabricage van liposomen en hoe deze kunnen worden geïmmobiliseerd op een oppervlak en afzonderlijk worden afgebeeld op een massale parallelle manier met behulp van fluorescentiemicroscopie. Dit zorgt voor de kwantificering van de grootte en compositorische inhomogeniteit tussen enkele liposomen van de populatie.
Abstract
De meeste onderzoek met liposomen als membraan modelsystemen of dragers van de levering van geneesmiddelen is afhankelijk van bulk read-out technieken en dus intrinsiek veronderstelt dat alle liposomen van het ensemble identiek zijn. Echter, nieuwe experimentele platforms die liposomen kunnen observeren op het niveau van één deeltje hebben het mogelijk gemaakt om zeer verfijnde en kwantitatieve studies uit te voeren over eiwit-membraan interacties of geneesmiddel drager eigenschappen op individuele liposomen, dus het voorkomen van fouten uit het ensemble gemiddelde. Hier presenteren we een protocol voor het voorbereiden, opsporen en analyseren van enkele liposomen met behulp van een microscopie-test op basis van fluorescentie, die dergelijke metingen van één deeltjes vergemakkelijkt. De Setup maakt het mogelijk om individuele liposomen op een enorme parallelle manier te laten zien en wordt gebruikt om intra-samplegrootte en compositionele inhomogeniteiten te onthullen. Bovendien beschrijft het protocol de voordelen van het bestuderen van liposomen op het enkele liposoom niveau, de beperkingen van de assay en de belangrijke functies die overwogen moeten worden bij het wijzigen van andere onderzoeksvragen.
Introduction
Liposomen zijn sferische fosfolipide-gebaseerde blaasjes die sterk worden gebruikt zowel in basis-en toegepast onderzoek. Ze functioneren als uitstekende membraan modelsystemen, omdat hun fysiochemische eigenschappen gemakkelijk kunnen worden gemanipuleerd door de lipide-componenten die de liposoom1,2vormen, tevariëren. Ook, liposomen vormen de meest gebruikte drug levering nanocarrier systeem, het aanbieden van verbeterde farmacokinetiek en farmacodynamiek, alsmede hoge biocompatibiliteit3.
Voor vele jaren, liposomen zijn voornamelijk bestudeerd met behulp van bulk technieken, geven alleen toegang tot ensemble gemiddelde uitleeswaarden. Dit heeft geleid tot de meerderheid van deze studies om aan te nemen dat alle liposomen in het ensemble identiek zijn. Dergelijke ensemble-gemiddelde waarden zijn echter alleen correct als de onderliggende gegevensset uniform is verdeeld rond de gemiddelde waarde, maar een valse en bevooroordeelde conclusie kan vertegenwoordigen als de gegevensset meerdere onafhankelijke populaties bevat, bijvoorbeeld. Bovendien, ervan uitgaande dat het ensemble betekent om de hele bevolking te vertegenwoordigen, kan de informatie die zich verveelt binnen de onhomogeniteit tussen liposomen, vergeten. Pas recentelijk zijn kwantitatieve testen naar voren gekomen die in staat zijn enkele liposomen te onderzoeken, waardoor grote homogeniteiten tussen individuele liposomen worden onthuld met betrekking tot belangrijke fysisch-chemische eigenschappen, waaronder liposoom size4, lipide-compositie5,6en inkapings efficiëntie7, waarbij het belang van het bestuderen van liposomen op het enkele liposoom niveau wordt benadrukt.
Een onderzoeksgebied waar het gemiddelde van de liposoom eigenschappen van het ensemble is aangetoond dat de resultaten van de liposoom grootte afhankelijke eiwit-membraan interacties8,9bestuderen. Traditioneel, onderzoekers bestuderen van dergelijke processen zijn beperkt tot het voorbereiden van liposomen met verschillende ensemble gemiddelde diameters door extrusie door middel van filters met verschillende porie maten9. Echter, het extraheren van de diameter van individuele liposomen met behulp van enkele liposoom-assays heeft grote populatie overlapt onthuld, met liposomen geëxtrudeerd met 100 nm en 200 nm-filters die tot 70% overlappen in hun grootteverdeling4. Dit kan ernstige bias bulk metingen van liposoom grootte afhankelijke eiwit-membraan interacties10. Het uitvoeren van de membraan-eiwit interactiestudies met behulp van de enkelvoudige liposoom Assay, onderzoekers in plaats daarvan profiteerde van de grootte-polydispersiteit in het monster, waardoor ze een breed scala van liposoom diameters binnen elk experiment te bestuderen, het faciliteren van nieuwe ontdekkingen van hoe membraan kromming en samenstelling kan invloed hebben op eiwit werving voor membranen4,11,12. Een ander gebied waar de toepassing van één liposoom assays heeft bewezen instrumentale is in mechanistische studies van eiwit-gemedieerde membraan fusie13,14. Voor dergelijke kinetische metingen, de mogelijkheid om individuele fusie-evenementen te bestuderen verlicht de noodzaak voor de experimentele synchronisatie van het fusieproces, waardoor nieuwe mechanistische inzichten die anders zou zijn verloren in de spatiotemporele gemiddelden gedaan in bulk ensemble metingen. Daarnaast zijn enkele liposomen gebruikt als een membraan steiger, waardoor individuele eiwitten kunnen worden gemeten en nieuwe kennis kan worden gemaakt over transmembraan proteïne Structural Dynamics15,16. Bovendien maakten dergelijke op proteoliposome gebaseerde opstellingen het mogelijk om de functie van individuele transmembraan transporters te bestuderen17 en Pore-vormende proteïne complexen18 en het mechanisme van bioactieve membraan-permeabilizing peptiden19. Enkele liposomen zijn ook gebruikt als zachte stof nanofluïdica met oppervlakte-geïmmobiliseerde enkele liposomen die als kamers dienen voor enzymatische reacties in volumes van 10-19 L, waardoor de doorvoer en complexiteit van de screening testen met minimaal productverbruik20.
Onlangs zijn enkele liposoom-assays gebruikt voor het karakteriseren van medicijn leveringsliposomen op een eerder onprecenspringende detailniveau. Onderzoekers waren in staat om significante inhomogeneities te kwantificeren in de hoeveelheid polymeer die aan het oppervlak van individuele liposomen is bevestigd21. De enkele liposoom assays ook toegestaan metingen van de levering van de drug liposomen in complexe media, zoals bloed plasma, onthullen hoe elementen verankerd aan het liposoom oppervlak door middel van lipide ankers kunnen worden vatbaar voor dissociatie wanneer liposomen worden blootgesteld aan omstandigheden nabootsen die ervaren tijdens in vivo circulatie22. Over het algemeen worden de veelzijdigheid en het nut van de enkelvoudige liposoom-assays onderbouwd door de grote verscheidenheid aan problemen die deze opstellingen hebben gehanteerd om aan te pakken, en we stellen voor dat de methodologie zal blijven worden ontwikkeld en het gebruik in nieuwe wetenschappelijke velden te vinden.
Hier beschrijven we een fluorescentiemicroscopie gebaseerde enkelvoudige liposoom assay die het mogelijk maakt individuele liposomen op een hoge doorvoer te laten studeren (Figuur 1). Om de methode te illustreren, gebruiken we het om de grootte en compositorische inhomogeniteit tussen individuele liposomen binnen een ensemble te kwantificeren. De assay maakt gebruik van fluorescentiemicroscoop beeldvorming van enkele liposomen geïmmobiliseerd op een gepassiveerde glazen oppervlak. We beschrijven eerst de kritische stappen in het liposoom fabricageproces dat zorgt voor een goede fluorescerende liposoom labeling en immobilisatie. Vervolgens beschrijven we de oppervlakte voorbereiding die nodig is om de liposoom-immobilisatie te vergemakkelijken voordat de procedure wordt beschreven voor het waarborgen van geschikte liposoom-oppervlakte dichtheden. We bespreken de microscopie parameters belangrijk voor het verwerven van afbeeldingen van hoge kwaliteit en afbakenen hoe eenvoudige data-analyse uit te voeren, waardoor de extractie van liposoom grootte en compositorische inhomogeniteit. Dit generieke protocol zou een goede basis moeten vormen voor de geïnteresseerde onderzoeker om de assay verder te ontwikkelen voor zijn of haar specifieke onderzoeksinteresse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is belangrijk op te merken dat hoewel we in detail beschrijven hoe de enkelvoudige liposomen test kan worden gebruikt om de compositorische inhomogeniteit tussen individuele liposomen te bestuderen, het platform zeer veelzijdig is. Zoals eerder getoond en besproken in de inleiding, het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan het bestuderen van aspecten van membraan-membraan fusie, eiwit-membraan interacties, of Liposomale drug Carrier karakterisering. Voor alle wetenschappelijke vragen die worden behandeld, lig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek [subsidie nummer 5054-00165B].
Materials
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
| Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are “Selected” upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
