個々のリポソーム間の組成不均一性を検出するための定量的蛍光顕微鏡ベースの単一リポソームアッセイ
Summary
このプロトコルは、リポソームの作製と、蛍光顕微鏡を用いて表面上に固定化し、個々に画像化する方法について説明します。これにより、集団の単一リポソーム間のサイズおよび組成不均一性の定量が可能になる。
Abstract
膜モデルシステムまたは薬物送達キャリアとしてリポソームを採用するほとんどの研究は、バルク読み出し技術に依存しているため、本質的にアンサンブルのすべてのリポソームが同一であると仮定します。しかし、単粒子レベルでリポソームを観察できる新しい実験プラットフォームにより、個々のリポソームに対するタンパク質膜相互作用または薬物担体特性に関する高度かつ定量的な研究を行うことが可能となり、したがって、アンサンブル平均からエラーを回避します。ここでは、蛍光ベースの顕微鏡アッセイを用いて単一リポソームを調製、検出、分析し、単粒子測定などを容易にするプロトコルを紹介する。セットアップは、大規模な並列方法で個々のリポソームをイメージングすることを可能にし、サンプル内のサイズと組成の不均一性を明らかにするために使用されます。さらに、このプロトコルは、単一のリポソームレベルでリポソームを研究することの利点、アッセイの限界、および他の研究問題を研究するためにそれを変更する際に考慮すべき重要な特徴を記述する。
Introduction
リポソームは、基礎研究と応用研究の両方で頻繁に使用されている球状リン脂質ベースの小胞です。それらは優れた膜モデルシステムとして機能し、その生理化学的性質は、リポソーム1、2を構成する脂質成分を変化させることによって容易に操作することができるのでである。また、リポソームは、最も使用される薬物送達ナノキャリアシステムを構成し、改善された薬物動態および薬力学ならびに高い生体適合性3を提供する。
長年にわたり、リポソームは主にバルク技術を使用して研究され、アンサンブル平均読み出し値にのみアクセスを与えてきました。これは、アンサンブル内のすべてのリポソームが同一であると仮定するために、これらの研究の大半を導いています。ただし、このようなアンサンブル平均値は、基になるデータセットが平均値の周りに均一に分布している場合にのみ正しいですが、データセットに複数の独立した母集団が含まれている場合など、誤った偏った結論を表すことができます。さらに、集団全体を表すアンサンブル平均を仮定すると、リポソーム間の不均一性の中で収容される情報を見落とすことができます。最近になってようやく単一のリポソームをプローブできる定量アッセイが出現し、リポソームサイズ4、脂質組成5、6、および封入効率7を含む重要な物理化学的性質に関して個々のリポソーム間の大きな不均一性を明らかにし、単一のリポソームレベルでリポソームを研究することの重要性を強調した。
リポソーム特性のアンサンブル平均がバイアス結果に示されている研究領域は、リポソームサイズ依存性タンパク質膜相互作用8、9を研究している。伝統的に、このようなプロセスを研究している研究者は、異なる細孔サイズ9を有するフィルターを通して押し出すことによって、異なるアンサンブル平均直径を有するリポソームを調製することに制限されてきました。しかしながら、単一リポソームアッセイを用いて個々のリポソームの直径を抽出すると、大きな集団の重複が明らかになり、リポソームは100nmおよび200nmフィルタを用いて押し出され、そのサイズ分布4において最大70%の重なりを示す。これは、リポソームサイズ依存性タンパク質膜相互作用10のバルク測定に大きく偏る可能性がある。単一のリポソームアッセイを用いて膜タンパク質相互作用研究を行い、研究者は代わりにサンプル内のサイズ多分散性を利用し、各実験内で広範囲のリポソーム直径を研究することができ、膜曲率および組成物が膜4、11、12にタンパク質のリクルートにどのように影響するかを新たに発見することを容易にした。単一リポソームアッセイの適用が実証された別の分野は、タンパク質媒介膜融合13、14の機械的研究である。このような運動学的測定では、個々の融合イベントを研究する能力により、融合プロセスの実験的同期の必要性が緩和され、バルクアンサンブル測定で行われた時空間平均で失われた新しい機械的洞察が可能になります。さらに、単一のリポソームは、膜足場として使用され、個々のタンパク質の測定を可能にし、膜貫通タンパク質構造ダイナミクス15、16に関する新しい知識を提供する。さらに、このようなプロテオオリポソームベースのセットアップにより、個々の膜貫通トランスポーター17および細孔形成タンパク質複合体18の機能ならびに生理活性膜透過性ペプチド19の機構を研究することができた。単一リポソームはまた、10−19Lの容積における酵素反応のためのチャンバーとして機能する表面固定化単一リポソームを有する軟質物質ナノ流体剤として使用されており、最小限の製品消費量20でスクリーニングアッセイのスループットおよび複雑さを増加させる。
近年、単一のリポソームアッセイは、以前は先行した詳細レベルでの薬物送達リポソームの特徴付けに用いられている。研究者は、個々のリポソーム21の表面に付着したポリマーの量において有意な不均一性を定量することができた。単一のリポソームアッセイはまた、血漿などの複雑な媒体における薬物送達リポソームの測定を可能にし、脂質アンカーを介してリポソーム表面に固定された元素が生体内循環22中に経験したものを模倣する条件にさらされると解離しやすいことを明らかにした。全体として、単一のリポソームアッセイの汎用性と有用性は、これらのセットアップが取り組むために採用されてきた多種多様な問題によって実証されており、方法論は引き続き開発され、新しい科学分野での使用を見つけることを想定しています。
ここでは、個々のリポソームを高スループットで研究することを可能にする蛍光顕微鏡ベースの単一リポソームアッセイについて説明する(図1)。この方法を説明するために、アンサンブル内の個々のリポソーム間のサイズと組成の不均一性を定量化するために使用します。アッセイは、不動態ガラス表面に固定化された単一リポソームの蛍光顕微鏡イメージングを採用している。まず、適切な蛍光リポソーム標識と固定化を保証するリポソーム製造プロセスにおける重要なステップについて説明します。次に、適切なリポソーム表面密度を確保するための手順を概説する前に、リポソーム固定化を容易にするために必要な表面調製物について説明する。高品質の画像を取得するために重要な顕微鏡パラメータについて議論し、簡単なデータ分析を行う方法を説明し、リポソームサイズと組成不均一性の抽出を可能にします。この一般的なプロトコルは、興味のある研究者が彼または彼女の特定の研究の関心のためにさらにアッセイを開発するための良い基礎を提供する必要があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
単一のリポソームアッセイを使用して個々のリポソーム間の組成不均質性を研究する方法を詳細に説明することは重要ですが、プラットフォームは非常に汎用性があります。導入で既に示したように、このプロトコルは、膜膜融合、タンパク質膜相互作用、またはリポソーム薬物担体特性評価の側面を研究するために容易に適応することができる。取り組まれている科学的な質問については?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はデンマーク独立研究評議会(補助金番号5054-00165B)によって資金提供されました。
Materials
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
| Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
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