개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석
Summary
이 프로토콜은 리포솜의 제조를 설명하고 이들이 어떻게 표면에 고정되고 형광 현미경 검사법을 사용하여 거대한 병렬 방식으로 개별적으로 심상될 수 있는지 설명합니다. 이는 집단의 단일 리포좀 들 사이의 크기 및 조성 불균질의 정량화를 허용한다.
Abstract
막 모형 시스템 또는 약 납품 운반대로 리포솜을 채택하는 대부분의 연구는 대량 판독 기술에 의존하고 따라서 본질적으로 앙상블의 모든 리포솜이 동일하다고 가정합니다. 그러나 단일 입자 수준에서 리포솜을 관찰할 수 있는 새로운 실험 플랫폼은 개별 리포좀에 대한 단백질 막 상호 작용 또는 약물 담체 특성에 대한 매우 정교하고 정량적인 연구를 수행할 수 있게 해 주었으며, 따라서 앙상블 평균에서 오류를 방지. 여기에서 우리는 형광 기지를 둔 현미경 분석법을 사용하여 단 하나 리포좀을 준비, 검출 및 분석하기 위한 프로토콜을 제시하고, 그 같은 단 하나 입자 측정을 촉진하. 이 설정은 개별 리포솜을 대규모 병렬 방식으로 이미징할 수 있게 하며 샘플 내 크기와 조성 불균질성을 드러내기 위해 사용됩니다. 추가적으로, 프로토콜은 단 하나 리포솜 수준에서 리포솜 공부의 이점, 분석결과의 한계 및 그밖 연구 질문을 공부하기 위하여 그것을 수정할 때 고려될 중요한 특징을 기술합니다.
Introduction
리포솜은 기초와 응용 연구 에서 둘 다 무겁게 이용되는 구형 인지질 기지를 둔 소포입니다. 이들은 우수한 멤브레인 모델 시스템으로 기능하며, 이들의 생리화학적 특성은 리포좀1,2를구성하는 지질 성분을 변화시킴으로써 쉽게 조작될 수 있기 때문이다. 또한, 리포솜은 향상된 약동학 및 약력학뿐만 아니라 높은 생체 적합성3을제공하는 가장 많이 사용되는 약물 전달 나노 캐리어 시스템을 구성합니다.
몇 년 동안, 리포솜은 주로 대량 기술을 사용하여 연구되어 앙상블 평균 판독 값에만 액세스 할 수 있습니다. 이것은 앙상블에 있는 모든 리포좀이 동일하다는 것을 가정하기 위하여 이 연구 결과의 대다수를 지도했습니다. 그러나 이러한 앙상블 평균 값은 기본 데이터 집합이 평균 값 주위에 균일하게 분포되어 있는 경우에만 정확하지만 데이터 집합에 여러 독립 모집단이 포함된 경우 거짓및 편향된 결론을 나타낼 수 있습니다. 또한, 전체 인구를 나타내는 앙상블 의미를 가정하면 리포솜 사이의 불균질성 내에 있는 정보를 간과할 수 있다. 최근에는 단일 리포좀을 조사할 수 있는 정량적 분석이 등장하여, 리포좀 크기4,지질조성5,6,및 캡슐화 효율7을포함한 중요한 물리화학적 특성에 대하여 개별 리포좀 들 사이의 큰 불균질성을 드러내며, 단일 리포좀 수준에서 리포좀을 연구하는 것의 중요성을 강조하고 있다.
리포솜 성질의 앙상블 평균화가 편향된 결과로 나타난 연구 영역은 리포솜 크기 의존성 단백질 막 상호작용을 연구하고있다8,9. 전통적으로, 이러한 과정을 연구하는 연구원은 다른 기공 크기9필터를통해 압출에 의해 다른 앙상블 평균 직경리포솜을 준비하는 것으로 제한되었습니다. 그러나, 단일 리포좀 어세스를 사용하여 개별 리포좀의 직경을 추출하는 것은 큰 인구 중복을 밝혀, 리포솜을 사용하여 압출 100 nm 및 200 nm 필터는 그들의 크기 분포에 70% 중첩까지 표시4. 이것은 리포솜 크기 의존성 단백질 막 상호작용10의대량 측정을 심각하게 편향시킬 수 있었다. 단일 리포솜 분석법을 사용하여 막 단백질 상호 작용 연구를 수행, 연구원은 대신 샘플 내에서 크기 다분산성을 활용, 각 단일 실험 내에서 리포좀 직경의 넓은 범위를 연구 할 수 있도록, 막 곡률과 조성이 막에 단백질 모집에 영향을 미칠 수있는 방법의 새로운 발견을 촉진4,11,12. 단일 리포솜 분석에 의한 또 다른 분야는 단백질 매개 막융합13,14의기계적 연구에 있다. 이러한 운동 측정의 경우 개별 융합 이벤트를 연구하는 능력은 융합 프로세스의 실험 적 동기화의 필요성을 완화하여 대량 앙상블 측정에서 수행되는 주공간 평균화에서 손실되었을 새로운 기계적 통찰력을 허용했습니다. 추가적으로, 단 하나 리포솜은 개별 적인 단백질의 측정을 허용하고 막 단백질 구조 역학15,16에새로운 지식을 제안하는 막 스캐폴드로 이용되었습니다. 더욱이, 이러한 프로테올리포좀 기반 설정은 개별 막 트랜스멤브레인수송기(17) 및 모공 형성 단백질복합체(18)의 기능뿐만 아니라 생리활성막-투과펩타이드(19)의 기전을 연구하는 것을 가능하게 하였다. 단일 리포솜은 또한10-19 L의 부피에서 효소 반응을 위한 챔버로서 사용되는 표면 고정된 단일 리포솜을 가진 연질 나노유체학으로서 사용되어 왔으며, 최소한의 제품소비로스크리닝 검거및 복잡성을 증가시키고 있다.
최근, 단일 리포솜 검사에서는 이전에 는 미리 정연하지 않은 수준의 세부 사항에서 약물 전달 리포좀을 특성화하는 데 사용되었습니다. 연구자들은 개별리포좀(21)의표면에 부착된 중합체의 양에서 유의한 불균질성을 정량화할 수 있었다. 단일 리포좀 검사는 또한 혈장과 같은 복합 매체에서 약물 전달 리포좀의 측정을 허용하고, 지질 앵커를 통해 리포좀 표면에 고정된 원소가 생체 내 순환 중에 경험한 조건을 모방하는 조건에 노출될 때 해리에 취약할 수 있는 방법을밝혀냅니다 22. 전반적으로, 단일 리포솜 assays의 다양성과 유용성은 이 설치가 해결하기 위하여 채택된 문제의 큰 다양성에 의해 입증되고, 우리는 방법론이 새로운 과학적인 필드에서 계속 개발되고 사용을 찾아내려고 구상합니다.
여기에서 우리는 개별 리포솜이 높은 처리량 방식으로 공부될 수 있도록 하는 형광 현미경 계 단 하나 리포좀 분석법을 기술합니다(그림 1). 이 방법을 설명하기 위해, 우리는 앙상블 내에서 개별 리포좀 사이의 크기와 조성 불균질성을 정량화하는 데 사용합니다. 이 분석은 통과 유리 표면에 고정된 단일 리포좀의 형광 현미경 이미징을 사용합니다. 우리는 먼저 적절한 형광 리포솜 라벨링 및 고정을 보장하는 리포솜 제조 공정의 중요한 단계를 설명합니다. 그런 다음, 적절한 리포솜 표면 밀도를 보장하기 위한 절차를 개략적으로 설명하기 전에 리포솜 고정을 용이하게 하는 데 필요한 표면 준비를 설명합니다. 우리는 고품질의 이미지를 획득하는 데 중요한 현미경 매개 변수에 대해 논의하고 간단한 데이터 분석을 수행하는 방법을 설명하여 리포솜 크기와 조성 불균질성을 추출 할 수 있습니다. 이 일반적인 프로토콜은 관심 있는 연구원이 그 또는 그녀의 특정 연구 관심사를 위한 분석학을 더 개발하기 위한 좋은 기초를 제공해야 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 단일 리포솜 분석이 개별 리포좀 사이의 조성 불균질성을 연구하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 자세히 설명하지만 플랫폼은 매우 다재다능하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이전에 소개에서 도시되고 논의된 바와 같이, 프로토콜은 막-막 융합, 단백질 막 상호 작용, 또는 리포좀 약물 담체 특성화의 양상을 연구하기 위해 용이하게 적응될 수 있다. 해결되는 모든 과학적 질문에 대?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 독립적 인 연구를위한 덴마크위원회에 의해 투자되었다 [보조금 번호 5054-00165B].
Materials
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
| Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
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