Nucleofección y Propagación In Vivo de Parásitos de La Eimeria de Pollo
Summary
Aquí, proporcionamos un método para lograr la transfección estable de parásitos de pollo Eimeria mediante la nucleofectación de esporozoitos o merozoites de segunda generación. Los parásitos eimerianos modificados genéticamente que expresen genes antigénicos hetrólogos podrían utilizarse como vehículos de administración de vacunas.
Abstract
La transfección es un proceso técnico a través del cual el material genético, como el ADN y el ARN de doble cadena, se entregan en las células para modificar el gen de interés. Actualmente, la tecnología transgénica se está convirtiendo en una herramienta indispensable para el estudio de Eimeria,los agentes causales de la coccidiosis en aves de corral y ganado. Este protocolo proporciona una descripción detallada de la transfección estable en parásitos eimerianos: purificación y nucleofección de esporozoítos o merozoitos de segunda generación, y propagación in vivo de parásitos transinfectados. Utilizando este protocolo, logramos la transfección en varias especies de Eimeria. En conjunto, la nucleofección es una herramienta útil para facilitar la manipulación genética en parásitos eimerianos.
Introduction
Eimeria spp. causa coccidiosis, lo que conduce a pérdidas económicas sustanciales en la industria ganadera y avícola. Aunque los medicamentos anticoccidiales, y en cierta medida, las vacunas anticoccidiales atenuadas, se han utilizado ampliamente para el control de la coccidiosis, todavía existen deficiencias con respecto a su resistencia a los medicamentos, residuos de drogas y la posible difusión de cepas vacunales que recuperan la virulencia1. Con el desarrollo de la biología molecular, la transfección se ha convertido en una herramienta vital para estudiar las funciones genéticas, desarrollar nuevas vacunas y detectar nuevas dianas farmacológicas para Eimeria.
En las últimas décadas, la transfección se ha aplicado con éxito para parásitos apicomplexianos como Plasmodium y Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Un estudio con la galone como reportero para la transfección en E. tenella pilotó tal trabajo en Eimeria7. La transfección de E. tenella8,9, E. mitis10,y E. acervulina (Zhang et al., datos inéditos) tuvo éxito en pollos. Recientemente, logramos la transfección utilizando merozoitas de E. necatrix a través de la nucleofección11.
Los estudios mostraron que Eimeria que expresa un antígeno hetrólogo tiene el potencial de desarrollarse como una vacuna recombinante, como las que expresan el antígeno A de Campylobacter jejuni (CjaA) o la interleucina de pollo 2 (chIL-2)12,13. Por lo tanto, este protocolo describe un estudio de nucleofección de Eimeria spp. en pollos. El procedimiento describe la purificación de esporozoítos o merozoitos, nucleofección con plasma, inoculación cloacal/inyección intravenosa y propagación in vivo para ayudar a los investigadores a iniciar estudios sobre parásitos transgénicos de Eimeria.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la década de 1990, se desarrolló un sistema de transfección para parásitos apicomplexanos, y se utilizó para estudios sobre parásitos eimerianos. Recientemente, se llevó a cabo un transfectado estable en E. tenella8,9 y E. nieschulzi15. Logramos la transfección estable de E. necatrix transfectando merozoites de segunda generación11. La inoculación de esporozoitas transtrofadas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFD0501200) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31572507, 31772728 y 31873007).
Materials
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
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