Her har vi givet en metode til at opnå stabil omladning af kylling Eimeria parasitter ved nucleofecting sporozoitter eller anden generation merozoitter. Genetisk modificerede eimeriske parasitter, der udtrykker heterologe antigengene, kan anvendes som vaccinefremføringskøretøjer.
Omladning er en teknisk proces, hvorigennem genetisk materiale, såsom DNA og dobbeltstrenget RNA, leveres til celler for at ændre genet af interesse. I øjeblikket er transgene teknologi ved at blive et uundværligt redskab til studiet af Eimeria, de forårsagende midler af coccidiose hos fjerkræ og husdyr. Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af stabil transfektion i eimeriske parasitter: rensning og nuklerofection af sporozoitter eller anden generations merozoitter, og in vivo formering af transfundere parasitter. Ved hjælp af denne protokol opnåede vi omladning i flere arter af Eimeria. Tilsammen er nukleofection et nyttigt redskab til at lette genetisk manipulation i eimeriske parasitter.
Eimeria spp. forårsager coccidiose, hvilket fører til betydelige økonomiske tab i husdyr- og fjerkræindustrien. Selv om anticoccidiale lægemidler, og til en vis grad, svækket anticoccidial vacciner, er blevet anvendt bredt til kontrol af coccidiose, der er stadig mangler med hensyn til deres resistens over for lægemidler, lægemiddelrester, og den potentielle spredning af vaccine stammer, der genvindeviencerul1. Med udviklingen af molekylærbiologi, omformning er blevet et vigtigt redskab til at studere genfunktioner, udvikle nye vacciner, og screening nye lægemiddelmål for Eimeria.
I de seneste årtier er omladning blevet anvendt med succes for apicomplexanske parasitter som Plasmodium og Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. En undersøgelse, der anvender β-gal som reporter for omladningen i E. tenella, afprøvede et sådant arbejde i Eimeria7. Omladningen af E. tenella8,9, E. mitis10, og E. acervulina (Zhang et al., ikke offentliggjorte data) var en succes i kyllinger. For nylig opnåede vi transfection ved hjælp af merozoites af E. necatrix gennem nucleofection11.
Undersøgelser viste, at Eimeria, der udtrykker et heterolog antigen, har potentiale til at blive udviklet som en rekombinantvaccine, såsom dem, der udtrykker Campylobacter jejuni antigen A (CjaA) eller kylling interleukin 2 (chIL-2)12,13. Derfor beskriver denne protokol en nucleofection undersøgelse af Eimeria spp. hos kyllinger. Proceduren beskriver rensning af sporozoitter eller merozoitter, kerner med plasmid DNA, cloacal podning / intravenøs injektion og in vivo formering for at hjælpe forskere starter undersøgelser af transgene Eimeria parasitter.
I 1990’erne blev der udviklet et transfektionssystem til apicomplexanske parasitter, og det blev brugt til undersøgelser af eimeriske parasitter. For nylig blev der gennemført stabil transfection i E. tenella8,9 og E. nieschulzi15. Vi opnåede den stabile transfection af E. necatrix ved at transfecting anden generation merozoitter11. Inokulering af transfected sporozoitter af E. acer…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Kinas nationale centrale forsknings- og udviklingsprogram (2017YFD0501200) og National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 og 31873007).
ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
DMEM | MACGENE | CM15019 | |
Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
Glucose | Sigma | No. V900116 | |
Glycine | Biotopped | G6200 | |
HBSS | MACGENE | CC016 | |
KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
MgCl2 | Sigma | 449164 | |
MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
PBS | Solarbio | P1010 | |
Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
Trypsin | Solarbio | T8150 | |
Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |