Nuklerofection og In Vivo Formering af kylling Eimeria Parasitter
Summary
Her har vi givet en metode til at opnå stabil omladning af kylling Eimeria parasitter ved nucleofecting sporozoitter eller anden generation merozoitter. Genetisk modificerede eimeriske parasitter, der udtrykker heterologe antigengene, kan anvendes som vaccinefremføringskøretøjer.
Abstract
Omladning er en teknisk proces, hvorigennem genetisk materiale, såsom DNA og dobbeltstrenget RNA, leveres til celler for at ændre genet af interesse. I øjeblikket er transgene teknologi ved at blive et uundværligt redskab til studiet af Eimeria, de forårsagende midler af coccidiose hos fjerkræ og husdyr. Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af stabil transfektion i eimeriske parasitter: rensning og nuklerofection af sporozoitter eller anden generations merozoitter, og in vivo formering af transfundere parasitter. Ved hjælp af denne protokol opnåede vi omladning i flere arter af Eimeria. Tilsammen er nukleofection et nyttigt redskab til at lette genetisk manipulation i eimeriske parasitter.
Introduction
Eimeria spp. forårsager coccidiose, hvilket fører til betydelige økonomiske tab i husdyr- og fjerkræindustrien. Selv om anticoccidiale lægemidler, og til en vis grad, svækket anticoccidial vacciner, er blevet anvendt bredt til kontrol af coccidiose, der er stadig mangler med hensyn til deres resistens over for lægemidler, lægemiddelrester, og den potentielle spredning af vaccine stammer, der genvindeviencerul1. Med udviklingen af molekylærbiologi, omformning er blevet et vigtigt redskab til at studere genfunktioner, udvikle nye vacciner, og screening nye lægemiddelmål for Eimeria.
I de seneste årtier er omladning blevet anvendt med succes for apicomplexanske parasitter som Plasmodium og Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. En undersøgelse, der anvender β-gal som reporter for omladningen i E. tenella, afprøvede et sådant arbejde i Eimeria7. Omladningen af E. tenella8,9, E. mitis10, og E. acervulina (Zhang et al., ikke offentliggjorte data) var en succes i kyllinger. For nylig opnåede vi transfection ved hjælp af merozoites af E. necatrix gennem nucleofection11.
Undersøgelser viste, at Eimeria, der udtrykker et heterolog antigen, har potentiale til at blive udviklet som en rekombinantvaccine, såsom dem, der udtrykker Campylobacter jejuni antigen A (CjaA) eller kylling interleukin 2 (chIL-2)12,13. Derfor beskriver denne protokol en nucleofection undersøgelse af Eimeria spp. hos kyllinger. Proceduren beskriver rensning af sporozoitter eller merozoitter, kerner med plasmid DNA, cloacal podning / intravenøs injektion og in vivo formering for at hjælpe forskere starter undersøgelser af transgene Eimeria parasitter.
Protocol
Representative Results
Discussion
I 1990’erne blev der udviklet et transfektionssystem til apicomplexanske parasitter, og det blev brugt til undersøgelser af eimeriske parasitter. For nylig blev der gennemført stabil transfection i E. tenella8,9 og E. nieschulzi15. Vi opnåede den stabile transfection af E. necatrix ved at transfecting anden generation merozoitter11. Inokulering af transfected sporozoitter af E. acer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Kinas nationale centrale forsknings- og udviklingsprogram (2017YFD0501200) og National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 og 31873007).
Materials
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
References
- Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
- Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
- Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
- Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
- Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
- Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
- Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188 (2014).
- Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
- Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).
- Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
- Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, 1-24 (1995).
- Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
- Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).
- Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).
- Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
- Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).
