ニワトリエイメリア寄生虫の核形成と生体内伝播
Summary
ここでは、スポロゾアイトや第二世代メロゾサイトを核電化して、ニワトリエイメリア寄生虫の安定したトランスフェクションを実現する方法を提供しました。異種抗原遺伝子を発現する遺伝子組み換えアイメリアン寄生虫はワクチン送達剤として用いることができる。
Abstract
トランスフェクションは、DNAや二本鎖RNAなどの遺伝物質を細胞に送達して目的の遺伝子を改変する技術プロセスです。現在、トランスジェニック技術は、家禽および家畜における尾骨症の原因物質であるエイメリアの研究に不可欠なツールになりつつあります。このプロトコルは、アイメリアン寄生虫における安定したトランスフェクションの詳細な説明を提供します:スポロゾーサイトまたは第二世代メロゾサイトの精製と核形成、およびトランスフェクト寄生虫の生体内伝播。このプロトコルを使用して、我々はエイメリアのいくつかの種でトランスフェクションを達成した。一緒に、 核素子は、アイメリアン寄生虫の遺伝子操作を容易にするのに有用なツールです。
Introduction
エイメリア属は尾骨症を引き起こし、家畜や家禽産業で大きな経済的損失を引き起こします。抗コクシディアル薬、およびある程度、減価された抗コクシディアルワクチンは、尾骨症の制御のために広く使用されているが、それらの薬剤耐性、薬物残基、および毒性を取り戻すワクチン株の潜在的な拡散に関する欠点は依然として1である。分子生物学の発展に伴い、遺伝子機能の研究、新しいワクチンの開発、エイメリアの新薬標的のスクリーニングに重要なツールとなっています。
過去数十年で、トランスフェクションは、マラリア原虫やトキソプラズマ・ゴンディ2、3、4、5、6などのアピコンプレックス寄生虫に対して正常に適用されてきました。E.テネラでのトランスフェクションのレポーターとしてβ-galを用いた研究は、エイメリア7でそのような仕事を操縦した。E. テネラ8,9, E. ミツ10,及びE.アセルヴリナ(張ら,未発表データ)のトランスフェクションは、ニワトリで成功した。最近、核不同を介してE.ゼネクトリクスのメロゾアテスを用いてトランスフェクションを達成した。
研究は、異種抗原を発現するエイメリアが、カンピロバクター・ケジュニ抗原A(CjaA)またはチキンインターロイキン2(chIL-2)12、13を発現するもののような組換えワクチンとして開発される可能性を有することを示した。したがって、このプロトコルは、ニワトリにおけるエイメリア属菌の核外突起研究を記述する。この手順は、スポロゾアイトまたはメロゾアイトの精製、プラスミドDNAによる核オフェクション、クロアカル接種/静脈注射および生体内伝播を記述し、研究者がトランスジェニック・エイメリア寄生虫の研究を開始するのを助ける。
Protocol
Representative Results
Discussion
1990年代には、アピコンプレックス寄生虫に対するトランスフェクションシステムが開発され、それが、それが、アイメリアン寄生虫の研究のために使用されました。最近、E.テネラ8、9およびE.ニエシュルジ15で安定したトランスフェクションが行われた。第二世代メロゾアイト11をトランスフェクシ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家主要研究開発計画(2017YFD0501200)と中国自然科学財団(31572507、31772728、31873007)によって支援されました。
Materials
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
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