Nukleofection och In Vivo förökning av kyckling eimeriaparasiter
Summary
Här gav vi en metod för att uppnå stabil transfection av kyckling Eimeria parasiter genom nucleofecting sporozoiter eller andra generationens merozoiter. Genetiskt modifierade eimerianparasiter som uttrycker heterologa antigena gener kan användas som vaccinleveransfordon.
Abstract
Transfection är en teknisk process genom vilken genetiskt material, såsom DNA och dubbelsträngade RNA, levereras till celler för att ändra genen av intresse. För närvarande är transgen teknik blir ett oumbärligt verktyg för studier av Eimeria, orsaksmedel coccidiosis i fjäderfä och boskap. Detta protokoll ger en detaljerad beskrivning av stabil transfection i eimerian parasiter: rening och nukleofection av sporozoiter eller andra generationens merozoiter, och in vivo förökning av transfected parasiter. Med hjälp av detta protokoll uppnådde vi transfection i flera arter av Eimeria. Tillsammans är nukleofection ett användbart verktyg för att underlätta genetisk manipulation hos eimerianparasiter.
Introduction
Eimeria spp. orsakar coccidiosis, vilket leder till betydande ekonomiska förluster inom boskaps- och fjäderfäindustrin. Även om antikoccidial läkemedel, och i viss mån, försvagade antikkockvacciner, har använts i stor utsträckning för kontroll av koccidios, det finns fortfarande brister när det gäller deras läkemedelsresistens, läkemedelsrester, och den potentiella spridningen av vaccin stammar som återfår virulens1. Med utvecklingen av molekylärbiologi har transfection blivit ett viktigt verktyg för att studera genfunktioner, utveckla nya vacciner och screening nya läkemedelsmål för Eimeria.
Under de senaste decennierna har transfection tillämpats framgångsrikt för apicomplexan parasiter som Plasmodium och Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. En studie med β-gal som reporter för transfection i E. tenella lotsas sådant arbete i Eimeria7. Transfection en E. tenella8,9, E. mitis10, och E. acervulina (Zhang et al., opublicerade data) var framgångsrik i kycklingar. Nyligen uppnådde vi transfection med hjälp av merozoiter av E. necatrix genom nukleofection11.
Studier visade att Eimeria uttrycker ett heterologous antigen har potential att utvecklas som ett rekombinant vaccin, såsom de som uttrycker Campylobacter jejuni antigen A (CjaA) eller kyckling interleukin 2 (chIL-2)12,13. Därför beskriver detta protokoll en nukleofection studie av Eimeria spp. i kycklingar. Förfarandet beskriver rening av sporozoiter eller merozoiter, nukleofection med plasmid DNA, cloacal inokulering/intravenös injektion och in vivo förökning för att hjälpa forskare att starta studier om transgena Eimeria parasiter.
Protocol
Representative Results
Discussion
På 1990-talet utvecklades ett transfectionsystem för apicomplexanparasiter, och det användes för studier på eimerianparasiter. Nyligen genomfördes stabil transfection i E. tenella8,9 och E. nieschulzi15. Vi uppnådde den stabila transfection av E. necatrix genom att transfecting andra generationens merozoiter11. Inokulering av transfected sporozoiter av E. acervulina genom v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Key Research and Development Program of China (2017YFD0501200) och National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 och 31873007).
Materials
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
References
- Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
- Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
- Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
- Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
- Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
- Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
- Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188 (2014).
- Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
- Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).
- Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
- Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, 1-24 (1995).
- Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
- Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).
- Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).
- Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
- Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).
