In-vivo-Mausmodell für Wirbelsäulenimplantatinfektionen

Summary

Das Protokoll beschreibt ein neuartiges In-vivo-Mausmodell für Wirbelsäulenimplantatinfektionen, bei dem ein K-Draht-Implantat aus Edelstahl mit biolumineszierendem Staphylococcus aureus Xen36 infiziert ist. Die bakterielle Belastung wird longitudinal mit biolumineszierender Bildgebung überwacht und mit koloniebildenden Einheitenzählungen nach Euthanasie bestätigt.

Abstract

Infektionen mit Wirbelsäulenimplantaten deuten auf schlechte Ergebnisse hin, da die Diagnose schwierig ist und die chirurgische Eradikation im Widerspruch zur mechanischen Stabilität der Wirbelsäule steht. Der Zweck dieser Methode ist es, ein neuartiges Mausmodell für spinale Implantatinfektionen (SII) zu beschreiben, das entwickelt wurde, um ein kostengünstiges, schnelles und genaues In-vivo-Werkzeug zum Testen potenzieller Therapeutika und Behandlungsstrategien für Wirbelsäulenimplantatinfektionen bereitzustellen.

In dieser Methode stellen wir ein Modell der posterioren Wirbelsäulenchirurgie vor, bei dem ein K-Draht aus Edelstahl in den Dornfortsatz L4 von 12 Wochen alten C57BL/6J-Wildtyp-Mäusen eingedrungen und mit 1 x 10³ KBE eines biolumineszierenden Stammes des Staphylococcus aureus Xen36-Bakteriums inokuliert wird. Die Mäuse werden dann an den postoperativen Tagen 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 und 35 in vivo longitudinal für Biolumineszenz abgebildet. Biolumineszenz-Bildgebungssignale (BLI) aus einem standardisierten Sichtfeld werden quantifiziert, um die bakterielle Belastung in vivo zu messen.

Um Bakterien zu quantifizieren, die an Implantaten und periimplantärem Gewebe haften, werden Mäuse euthanasiert und das Implantat und das umgebende Weichgewebe entnommen. Die Bakterien werden durch Beschallung vom Implantat gelöst, über Nacht kultiviert und dann werden koloniebildende Einheiten (KBE) gezählt. Zu den Ergebnissen, die mit dieser Methode gewonnen werden, gehören longitudinale Bakterienzahlen, gemessen durch in vivo S. aureus-Biolumineszenz (mittlerer maximaler Fluss) und KBE-Zählungen nach Euthanasie.

Während frühere Tiermodelle für instrumentierte Wirbelsäuleninfektionen eine invasive Ex-vivo-Gewebeanalyse beinhalteten, nutzt das in dieser Arbeit vorgestellte Mausmodell der SII die nicht-invasive, optische Echtzeit-In-vivo-Bildgebung von biolumineszierenden Bakterien, um statische Gewebeuntersuchungen zu ersetzen. Die Anwendungen des Modells sind breit gefächert und können die Verwendung alternativer biolumineszierender Bakterienstämme, die Einbeziehung anderer Arten von gentechnisch veränderten Mäusen zur gleichzeitigen Untersuchung der Immunantwort des Wirts und die Bewertung aktueller oder die Untersuchung neuer diagnostischer und therapeutischer Modalitäten wie Antibiotika oder Implantatbeschichtungen umfassen.

Introduction

Das Ziel dieser Methode ist es, ein neuartiges Mausmodell der spinalen Implantatinfektion (SII) zu beschreiben. Dieses Modell wurde entwickelt, um ein kostengünstiges und genaues Werkzeug zur flexiblen Bewertung der Wirkung von Wirts-, Erreger- und/oder Implantatvariablen in vivo bereitzustellen. Die Erprobung potenzieller Therapeutika und Behandlungsstrategien für Wirbelsäulenimplantatinfektionen in diesem Modell zielt darauf ab, die Forschungsentwicklung vor der Anwendung in größeren Tiermodellen und klinischen Studien zu steuern.

Implantatbedingte Infektionen nach Wirbelsäulenoperationen sind eine verheerende Komplikation und treten leider bei etwa 3–8 % der Patienten auf, die sich einer elektiven Wirbelsäulenoperation unterziehen 1,2,3,4,5 und bis zu 65 % der Patienten, die sich einer Mehrebenen- oder Revisionsoperation unterziehen ⁶. Die Behandlung von Wirbelsäulenimplantatinfektionen erfordert oft mehrere Krankenhausaufenthalte, mehrere Operationen und eine längere Antibiotikatherapie. SIIs deuten auf schlechte Patientenergebnisse hin, einschließlich neurologischer Beeinträchtigungen, Behinderungen und eines erhöhten Mortalitätsrisikos. Die Behandlung von SII ist extrem teuer und kostet mehr als 900.000 US-Dollar pro Patient⁷.

Staphylococcus aureus ist der häufigste virulente Erreger von SII 8,9,10,11. Bakterien können die Hardware direkt während der Operation, durch die Wunde während der postoperativen Phase oder später durch hämatogene Ausbreitung aussäen. In Gegenwart von Metallimplantaten bildet S. aureus einen Biofilm, der die Bakterien vor einer Antibiotikatherapie und Immunzellen schützt. Während die Entfernung infizierter Hardware dazu beitragen kann, eine Infektion effektiv auszurotten, ist dies in der Wirbelsäule häufig nicht möglich, ohne eine Destabilisierung zu verursachen und eine neurologische Beeinträchtigung zu riskieren¹².

Da infizierte Hardware nicht explantiert werden kann, sind neue Ansätze zur Vorbeugung, Erkennung und Behandlung von SII erforderlich. In der Vergangenheit gab es nur begrenzte Tiermodelle für SII, um die Sicherheit und Wirksamkeit neuartiger Therapien effizient zu bewerten. Bisherige Tiermodelle der SII erfordern eine große Anzahl von Tieren und die Erfassung von Datenpunkten, die Euthanasie erfordern, einschließlich Koloniezählung, Histologie und Kultur^13,14,15. Da es keine longitudinale In-vivo-Überwachung gibt, liefern diese Modelle nur einen Datenpunkt pro Tier und sind daher teuer und ineffizient.

Frühere Arbeiten zur Untersuchung eines Mausmodells für Knieendoprothetikinfektionen erwiesen den Wert und die Genauigkeit der nicht-invasiven optischen In-vivo-Bildgebung zur longitudinalen Überwachung der Infektionslast¹⁶. Der Nachweis von Biolumineszenz ermöglicht es, die bakterielle Belastung über einen longitudinalen Zeitverlauf in einem einzelnen Tier human, genau und effizient zu quantifizieren. Darüber hinaus haben frühere Studien eine hohe Korrelation zwischen In-vivo-Biolumineszenz und an Implantaten haftenden KBE gezeigt¹⁷. Die Fähigkeit, Infektionen im Laufe der Zeit zu verfolgen, hat zu einem nuancierteren Verständnis von implantatbedingten Infektionen geführt. Darüber hinaus hat die Überwachung der longitudinalen Infektion auf diese Weise eine genaue Bewertung der Wirksamkeit der Antibiotikatherapie und neuartiger antimikrobieller Mittel ermöglicht^16,17,18.

Mit Hilfe dieser Werkzeuge haben wir ein Modell der postoperativen Wirbelsäulenimplantatinfektion entwickelt und validiert. In der vorgestellten Methode verwenden wir ein Inokulum von biolumineszierendem S. aureus Xen36, um ein in vivo Mausmodell der SII zu etablieren, um die bakterielle Belastung longitudinal zu überwachen^16,17,18. Dieses neuartige Modell bietet ein wertvolles Werkzeug, um potenzielle Erkennungs-, Präventions- und Behandlungsstrategien für SII effizient zu testen, bevor sie in größeren Tiermodellen und klinischen Studien angewendet werden.

Protocol

Alle Tiere wurden in strikter Übereinstimmung mit der guten Tierpraxis behandelt, wie sie in den Bundesvorschriften definiert ist, wie sie im Tierschutzgesetz (AWA), dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von 1996, der PHS-Richtlinie für die humane Pflege und Verwendung von Labortieren sowie in den Richtlinien und Verfahren der Einrichtung festgelegt sind, wie sie im Schulungshandbuch für die Pflege und Verwendung von Tieren festgelegt sind. und alle Tierarbeiten wurden vom Animal Research Commi…

Representative Results

Das hier vorgestellte Verfahren wurde verwendet, um die Wirksamkeit von Antibiotikatherapien in einem in vivo Mausmodell der SII zu bewerten. Insbesondere wurde die Wirksamkeit einer kombinierten Antibiotikatherapie mit Vancomycin und Rifampicin mit einer Vancomycin-Monotherapie und unbehandelten infizierten Kontrollen verglichen. Vor der Operation wurden die Mäuse entweder einer Kombinationstherapie, einer Monotherapie oder einer infizierten Kontrolle zugeteilt. Eine statistische Poweranalys…

Discussion

Implantatbedingte Infektionen in der Wirbelsäule deuten auf schlechte Ergebnisse für die Patienten hin 1,2,3,4,5. Im Gegensatz zu vielen anderen Bereichen im Körper kann infizierte Hardware in der Wirbelsäule aufgrund des Risikos von Instabilität und neurologischer Beeinträchtigung häufig nicht entfernt werden. Diese einzigartige Herausforderung im Umfe…

Materials

Analytical Balance ME104	Mettler Toledo	30029067	120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208300	Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor	Thermo Scientific	75003183	Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator)	Branson Ultrasonics	CPX952217R	*similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
Bullet Blender Storm Homogenizer	Next Advance	BBY24M	The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes.
Germinator 500	Electron Microscopy Sciences	66118-10	The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System	Perkin Elmer	CLS148590	The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker	Thermo Scientific	SHKE4450	Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline	Fisher Bioreagents	BP24384	PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated	Thermo Scientific	75002436	24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge	Thermo Scientific	75004261	Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus – Xen36	Perkin Elmer	119243	Staphylococcus aureus – Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V	Heidolph Tuttnauer	23210401	Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80	Fisher Bioreagents	BP338-500	Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200	Labnet Internation	S0200	120V touch or continuous mixer, 230V: 0 – 2,850 rpm,120V: 0 – 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride	Pfizer Injectables/Hospira	00409-4888-10	0.9% Sodium Chloride Injection, USP