척추 임플란트 감염의 In Vivo 마우스 모델

Summary

이 프로토콜은 스테인리스강 k-와이어 임플란트가 생물 발광 황색포도상구균 Xen36에 감염된 척추 임플란트 감염의 새로운 생체 내 마우스 모델을 설명합니다. 박테리아 부담은 생물 발광 이미징으로 종단적으로 모니터링되고 안락사 후 콜로니 형성 단위 수로 확인됩니다.

Abstract

척추 임플란트 감염은 진단이 어렵고 외과적 박멸이 기계적 척추 안정성과 상충되기 때문에 좋지 않은 결과를 예고합니다. 이 방법의 목적은 척추 임플란트 감염에 대한 잠재적인 치료법 및 치료 전략을 테스트하기 위해 저렴하고 신속하며 정확한 생체 내 도구를 제공하기 위해 만들어진 척추 임플란트 감염(SII)의 새로운 마우스 모델을 설명하는 것입니다.

이 방법에서는 12주 된 C57BL/6J 야생형 마우스의 L4 가시 돌기에 스테인리스 스틸 k-와이어를 고정하고 황색포도상구균 Xen36 박테리아의 생물 발광 균주 1 x 10³ CFU를 접종하는 후방 접근 척추 수술 모델을 제시합니다. 그런 다음 마우스는 수술 후 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 및 35일에 생체 내 생물 발광을 위해 종방향으로 이미징됩니다. 표준화된 시야의 생물발광 이미징(BLI) 신호를 정량화하여 생체 내 박테리아 부담을 측정합니다.

임플란트 및 임플란트 주위 조직에 부착하는 박테리아를 정량화하기 위해 마우스를 안락사시키고 임플란트와 주변 연조직을 채취합니다. 박테리아는 초음파 처리에 의해 임플란트에서 분리되고 밤새 배양 된 다음 콜로니 형성 단위 (CFU)가 계산됩니다. 이 방법에서 얻은 결과에는 in vivo S. aureus bioluminescence(평균 최대 플럭스)로 측정한 종적 박테리아 수와 안락사 후 CFU 수가 포함됩니다.

기구 척추 감염의 이전 동물 모델에는 침습적 생체 외 조직 분석이 포함되었지만, 이 논문에서 제시된 SII의 마우스 모델은 정적 조직 연구를 대체하기 위해 생물 발광 박테리아의 비침습적 실시간 생체 내 광학 이미징을 활용합니다. 이 모델의 응용 분야는 광범위하며 대체 생물 발광 박테리아 균주를 활용하고, 숙주 면역 반응을 동시에 연구하기 위해 다른 유형의 유전자 조작 마우스를 통합하고, 항생제 또는 임플란트 코팅과 같은 현재 또는 새로운 진단 및 치료 방식을 평가하거나 조사하는 것이 포함될 수 있습니다.

Introduction

이 방법의 목적은 척추 임플란트 감염(SII)의 새로운 마우스 모델을 설명하는 것입니다. 이 모델은 생체 내에서 숙주, 병원체 및/또는 임플란트 변수의 영향을 유연하게 평가할 수 있는 저렴하고 정확한 도구를 제공하도록 설계되었습니다. 이 모델에서 척추 임플란트 감염에 대한 잠재적 치료법 및 치료 전략을 테스트하는 것은 대규모 동물 모델 및 임상 시험에 적용하기 전에 연구 개발을 안내하는 것을 목표로 합니다.

척추 수술 후 임플란트 관련 감염은 치명적인 합병증으로, 안타깝게도 선택적 척추 수술을 받은 환자의 약 3-8%에서 발생하며1,2,3,4,5 다 단계 또는^{재수술을 받은} 환자의 최대 65%에서 발생한다⁶. 척추 임플란트 감염을 치료하려면 여러 번의 입원, 여러 번의 수술 및 장기간의 항생제 치료가 필요한 경우가 많습니다. SII는 신경학적 손상, 장애 및 사망 위험 증가를 포함하여 좋지 않은 환자 결과를 예고합니다. SII의 관리는 환자 한 명당 $900,000 이상의 비용이 들 정도로 매우 비쌉니다⁷.

황색포도상구균은 SII 8,9,10,11의 가장 흔한 악성 병원체입니다. 박테리아는 수술 중에 직접 하드웨어를 파종할 수 있으며, 수술 후 기간 동안 상처를 통해 또는 나중에 혈액 확산을 통해 시드될 수 있습니다. 금속 임플란트가 있는 경우 S. aureus는 항생제 요법 및 면역 세포로부터 박테리아를 보호하는 생물막을 형성합니다. 감염된 하드웨어를 제거하는 것은 감염을 효과적으로 근절하는 데 도움이 될 수 있지만, 척추를 불안정하게 만들고 신경학적 손상을 초래하지 않고는 척추에서 감염을 제거할 수 없는 경우가 많다¹².

감염된 하드웨어를 이식하지 않는 경우 SII를 예방, 탐지 및 치료하기 위한 새로운 접근 방식이 필요합니다. 역사적으로 새로운 치료법의 안전성과 효능을 효율적으로 평가하기 위한 SII의 동물 모델은 제한적이었습니다. SII의 이전 동물 모델은 많은 수의 동물과 콜로니 카운팅, 조직학 및 배양을 포함하여 안락사를 필요로 하는 데이터 포인트의 수집을 필요로 한다^13,14,15. 종단적 in vivo 모니터링이 없는 이러한 모델은 동물당 하나의 데이터 포인트만 제공하므로 비용이 많이 들고 비효율적입니다.

무릎 인공관절 치환술 감염의 마우스 모델을 연구한 이전 연구는 감염 부담을 종단적으로 모니터링하기 위한 비침습적 생체 내 광학 영상의 가치와 정확도를 확립했다¹⁶. 생물 발광의 검출을 통해 박테리아 부담을 단일 동물의 종적 시간 과정에 걸쳐 인도적이고 정확하며 효율적으로 정량화할 수 있습니다. 더욱이, 선행 연구들은 생체 내 생물 발광과 임플란트에 부착된 CFU 사이에 높은 상관관계가 있음을 보여주었다¹⁷. 시간이 지남에 따라 감염을 추적할 수 있는 능력은 임플란트 관련 감염에 대한 보다 미묘한 이해로 이어졌습니다. 또한 이러한 방식으로 종단 감염을 모니터링하여 항생제 요법 및 새로운 항균제의 효과를 정확하게 평가할 수 있었습니다^16,17,18.

이러한 도구를 활용하여 수술 후 척추 임플란트 감염 모델을 개발하고 검증했습니다. 제시된 방법에서, 우리는 박테리아 부담 ^16,17,18을 종방향으로 모니터링하기 위해 SII의 생체 내 마우스 모델을 확립하기 위해 생물 발광 S. aureus ^Xen36의 접종물을 사용합니다. 이 새로운 모델은 대규모 동물 모델 및 임상 시험에 적용하기 전에 SII에 대한 잠재적 검출, 예방 및 치료 전략을 효율적으로 테스트할 수 있는 귀중한 도구를 제공합니다.

Protocol

모든 동물은 동물 복지법(AWA), 1996년 실험 동물 관리 및 사용 가이드, 실험 동물의 인도적 관리 및 사용을 위한 PHS 정책, 동물 관리 및 사용 교육 매뉴얼에 명시된 기관의 정책 및 절차에 명시된 연방 규정에 정의된 모범 동물 관행에 따라 엄격하게 취급되었습니다. 모든 동물 연구는 캘리포니아 대학교 로스 앤젤레스 총장의 동물 연구위원회 (ARC)의 승인을 받았습니다. 1. S. au…

Representative Results

여기에 제시된 절차는 SII의 생체내 마우스 모델에서 항생제 요법의 효능을 평가하는 데 사용되었습니다. 구체적으로, 반코마이신과 리팜핀 항생제 병용요법의 효능을 반코마이신 단독요법 및 치료되지 않은 감염 대조군과 비교하였다. 수술 전에 마우스는 병용 요법, 단일 요법 또는 감염 대조군에 무작위 배정되었습니다. 표본 크기를 계산하기 위해 통계적 검정력 분석을 수…

Discussion

척추의 임플란트 관련 감염은 환자에게 좋지 않은 결과를 예고한다 1,2,3,4,5. 신체의 다른 많은 부위와 달리 척추의 감염된 하드웨어는 불안정성과 신경학적 손상의 위험으로 인해 제거할 수 없는 경우가 많습니다. 전신 항생제 치료에 내성이 있는 생물막 박테리아 설정에서 …

Materials

Analytical Balance ME104	Mettler Toledo	30029067	120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208300	Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor	Thermo Scientific	75003183	Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator)	Branson Ultrasonics	CPX952217R	*similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
Bullet Blender Storm Homogenizer	Next Advance	BBY24M	The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes.
Germinator 500	Electron Microscopy Sciences	66118-10	The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System	Perkin Elmer	CLS148590	The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker	Thermo Scientific	SHKE4450	Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline	Fisher Bioreagents	BP24384	PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated	Thermo Scientific	75002436	24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge	Thermo Scientific	75004261	Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus – Xen36	Perkin Elmer	119243	Staphylococcus aureus – Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V	Heidolph Tuttnauer	23210401	Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80	Fisher Bioreagents	BP338-500	Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200	Labnet Internation	S0200	120V touch or continuous mixer, 230V: 0 – 2,850 rpm,120V: 0 – 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride	Pfizer Injectables/Hospira	00409-4888-10	0.9% Sodium Chloride Injection, USP