Перфузия и инфляция мышиного легкого для гистологии опухолей

Summary

Целью данного метода является представление простого и эффективного метода перфузии, инфляции и фиксации легких мыши для исследования патологии опухоли легких и оценки метастазов в легкие.

Abstract

Способность оценивать гистологию легких имеет решающее значение для областей исследований рака легких и метастазов рака. Не менее важно проводить некропсию быстро и эффективно из исследований, не жертвуя качеством закупаемых тканей. Цель этого протокола состоит в том, чтобы представить метод быстрого окутывания, надувания и фиксации легких мыши для гистологического анализа ниже по течению. Этот метод не стандартизирует инфляцию легких; таким образом, он не требует каких-либо специальных процедур или оборудования, а вместо этого просто прививает фиксатор непосредственно через трахею после перфузии через сердце. Это позволяет достаточно оценить размер опухоли, гистологию и скоринг. Это также позволяет для сбора замороженных тканей до фиксации легочной ткани. Этот метод ограничен в том, что он не позволяет позднее морфометрической количественной оценки легких; однако, это более чем достаточно для анализа опухоли легких с генетически модифицированных моделей мыши (GEMMs), сингенеических моделей, а также ксенотрансплантатной опухоли и метастазирования исследований.

Introduction

Различные мыши модели онкогенеза легких и метастазов рака в легкие существуют, начиная от сложных GEMMs к канцерогенным моделям сингенеических и ксенотрансплантных моделей, где раковые клетки вводят через интракардию, интраторакальные, хвостовой вены, или другие методы для создания опухолей в легких. Все эти модели имеют общую потребность в гистологической оценке гистологии легких и патологии. Таким образом, необходимо иметь надежный, но быстрый метод для выполнения некропсии мышей при перфузации легких, чтобы удалить избыток крови, и надувание и фиксация легких, чтобы четко визуализировать архитектуру легких. Скорость является важнейшим компонентом этой процедуры, как это может быть необходимо для сбора легких от десятков мышей в одной точке времени. Эта процедура может быть выполнена менее чем за 6 минут на мышь.

Хотя эта процедура более чем достаточна для оценки гистологии опухоли, она не рекомендуется для тех, кто хочет выполнить стереологию или морфометрические измерения легких. Такие измерения требуют стандартизации инфляции легких, а также расчета абсолютной площади поверхности легких, абсолютного объема и альвеолярного размера и^{числа 1.} Этот метод также не является оптимальным для некоторых подходов к визуализации. Например, визуализация легких с помощью КТ для экз-виво морфометрического анализа требует, чтобы легкие оставались заполненными воздухом^2. Когда сохранение воздушного пространства и размеров являются главной заботой, рекомендуется исправить легкие перфузии обезвоживания^{методы 3,4}. Одной из самых больших проблем этой модели является возможность разрыва альвеолярных стен, уменьшая ее использование в исследованиях эмфиземы; однако, рекомендуемая процедура фиксации легких для изучения эмфиземы по-прежнему очень похожа, так как рекомендуется исправить легкие либо путем внутритрахеальной закапывания 10% формалина (по аналогии с протоколом, описанным здесь) при постоянном давлении жидкости или путем фиксации^{на месте 5.}

Преимущество описанной процедуры здесь заключается в том, что она не требует постоянного давления жидкости, вместо этого раздувая легкие, пока они полностью не расширились, тем самым уменьшая время, необходимое для процедуры. Описанная здесь процедура очень напоминает методы, рекомендованные арсеналом Общества токсикологической патологии, где был сформирован подкомитет для рекомендации лучших методов фиксации легких для токсикологических исследований. Большинство ученых в рамках этого подкомитета рекомендовал фиксации легких путем интратрахеальной прививки шприцем, хотя были различные рекомендации о времени, когда легкое осталось в^{фиксатор 6}. Таким образом, в то время как различные методы инфляции легких и фиксации существуют, метод, описанный в настоящем предлагается в качестве оптимального метода для быстрого раздувания и фиксации легких для вниз по течению гистологической оценки опухоли.

Protocol

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Алабамы в Бирмингеме. 1. Экспериментальный протокол Пожертвуйте мышью с помощью утвержденного метода IACUC. Здесь мы использовали вывих шей?…

Representative Results

Вышеупомянутый протокол позволяет быстро перфузии, инфляции и фиксации легких мыши. Цифры, показанные ниже, отражают важность каждого шага. На рисунке 1 изображены окрашенные легкие, которые были пронизаны PBS и легких, в которых шаг перфузии был пропущен или легкие не см?…

Discussion

Описанная выше процедура перфузии, инфляции и фиксации легких мыши идеально подходит для быстрой и эффективной подготовки легких мыши к гистологии опухоли легких и анализу патологии. Процедура не требует специального оборудования и может быть выполнена менее чем за 6 минут на мышь. Пр?…

Materials

10% buffered formalin	Fisher	23-245685
22 G Needle	BD	305155
3 mL syringe	BD	309656
70% Ethanol	Decon	2405
Forceps	Harvard Apparatus	72-8595
Heparin	Fisher	H19
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-030-CV
Surgical scissors	Harvard Apparatus	72-8428