זלוף ואינפלציה של ריאת העכבר עבור היסטולוגיה גידול
Summary
מטרת שיטה זו היא להציג שיטה פשוטה ויעילה עבור זלוף, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר לבדיקת פתולוגיה גידול ריאות והערכת גרורות לריאה.
Abstract
היכולת להעריך היסטולוגיה של ריאות היא קריטית לתחומי חקר סרטן ריאות וגרורות סרטן. חשוב באותה מידה לבצע necropsies במהירות וביעילות ממחקרים מבלי להקריב את איכות הרקמות שנרכשו. מטרת פרוטוקול זה היא להציג שיטה להחדיר במהירות, לנפח ולתקן ריאות עכבר לניתוח היסטולוגי במורד הזרם. שיטה זו אינה מתקן את אינפלציית הריאות; לכן, זה לא דורש כל נהלים מיוחדים או ציוד ובמקום זאת פשוט מחדיר קיבוע ישירות דרך קנה הנשימה בעקבות זלוף דרך הלב. זה מאפשר הערכה מספקת של גודל הגידול, היסטולוגיה, וניקוד. זה גם מאפשר איסוף של רקמה קפואה לפני קיבוע רקמת הריאה. שיטה זו מוגבלת בכך שהיא אינה מאפשרת כימות מורפומטרי מאוחר יותר של הריאה; עם זאת, זה יותר ממספיק לניתוח גידול ריאות ממודלים עכבר מהונדסים גנטית (GEMMs), מודלים סינגניים, כמו גם גידול קסנוגרפט ומחקרי גרורות.
Introduction
קיימים מגוון דגמי עכברים של אונקוגנזה ריאה וגרורות סרטן לריאה, החל מ- GEMMs מורכבים ועד דגמים הנגרמים על ידי מסרטן ועד מודלים סינגניים ושנאת זרים, שבהם מוזרקים תאים סרטניים באמצעות אינטרקרדיאק, תוך-עורית, וריד הזנב או שיטות אחרות לביסוס גידולים בריאה. כל המודלים האלה חולקים את הצורך המשותף להערכה היסטולוגית של היסטולוגיה של ריאות ופתולוגיה. לכן, יש צורך בשיטה חזקה אך מהירה לבצע necropsies של עכברים תוך זלוף הריאות כדי להסיר דם עודף, ניפוח ותיקון הריאות כדי לדמיין בבירור את ארכיטקטורת הריאות. מהירות היא מרכיב קריטי של הליך זה כפי שייתכן שיהיה צורך לאסוף את הריאות מעשרות עכברים בנקודת זמן אחת. ניתן לבצע הליך זה בפחות מ- 6 דקות לכל עכבר.
בעוד הליך זה הוא יותר ממספיק להערכת היסטולוגיה הגידול, זה לא מומלץ עבור אלה המעוניינים לבצע מדידות סטריאולוגיה או morphometric של הריאות. מדידות כאלה דורשות אינפלציית ריאות להיות סטנדרטית, כמו גם את החישוב של שטח הפנים המוחלט של הריאה, נפח מוחלט, וגודל מכתשי ומספר1. שיטה זו גם אינה אופטימלית עבור גישות הדמיה מסוימות. לדוגמה, הדמיה של הריאות באמצעות μCT לניתוח מורפומטרי אקס ויוו דורשת שהריאות יישארו מלאות באוויר2. כאשר שימור המרחבים והממדים האוויריים הם הדאגה העיקרית, מומלץ לתקן את הריאות על ידי טכניקות התייבשות זלוף3,4. אחד החששות הגדולים ביותר של מודל זה הוא הפוטנציאל לקרע של קירות מכתשים, להפחית את השימוש בו במחקרים של נפחת; עם זאת, ההליך המומלץ לקיבעון הריאות לחקר אמפיזמה עדיין דומה למדי, שכן מומלץ לתקן את הריאות או על ידי החדרה תוך-טרה-סחית של 10% פורמלין (בדומה לפרוטוקול המתואר כאן) תחת לחץ נוזלים מתמיד או על ידי קיבוע5.
היתרון של ההליך המתואר כאן הוא שזה לא דורש לחץ נוזלים מתמיד, במקום לנפח את הריאות עד שהם התרחבו באופן מלא, ובכך להקטין את הזמן הדרוש להליך. ההליך המתואר כאן דומה מאוד לשיטות המומלצות על ידי חימוש של האגודה לפתולוגיה טוקסיקולוגית, שם הוקמה ועדת משנה להמליץ על השיטות הטובות ביותר של קיבוע ריאות למחקרי רעלים. רוב המדענים בתוך ועדת משנה זו המליצו לתקן את הריאות על ידי החדרה תוך-סטריאלית עם מזרק, אם כי היו המלצות שונות בזמן שהריאה הושארה בקיבעון6. לכן, בעוד מגוון שיטות של אינפלציה ריאות קיבעון קיים, השיטה המתוארת בזאת מוצע להיות השיטה האופטימלית במהירות לנפח ולתקן את הריאות להערכה היסטולוגית גידול במורד הזרם.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליך המתואר לעיל עבור זלוף, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר הוא אידיאלי עבור הכנה מהירה ויעילה של ריאות העכבר עבור היסטולוגיה גידול ריאות וניתוח פתולוגיה. ההליך אינו דורש כל ציוד מיוחד והוא יכול להתבצע בתוך פחות מ 6 דקות לכל עכבר. ההליך אינו דורש נפח קבוע לאינפלציה או לחץ נוזלים מתמיד. מכיו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום תחת מספר הפרס UL1TR003096 (MDE), מלגת הלב, הריאות והמכון הלאומי למחלות ריאה 5T32HL134640 (MLD).
Materials
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography. Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).
- Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. Lung fixation for the preservation of air spaces. Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).
- Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions. Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species. American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).
- Edmonds, M. D., et al. MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).
- Zhao, K., et al. Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways. PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).
