Perfusão e Inflação do Pulmão do Rato para Histologia tumoral
Summary
O objetivo deste método é apresentar um método simples e eficiente para a perfusão, inflação e fixação de pulmões de camundongos para o exame da patologia do tumor pulmonar e avaliação de metástases no pulmão.
Abstract
A capacidade de avaliar a histologia pulmonar é fundamental para os campos da pesquisa sobre câncer de pulmão e metástase do câncer. É igualmente importante realizar necropsias de forma rápida e eficiente a partir de estudos sem sacrificar a qualidade dos tecidos adquiridos. O objetivo deste protocolo é apresentar um método para perfusear rapidamente, inflar e fixar pulmões de camundongos para análise histológica a jusante. Este método não padroniza a inflação pulmonar; assim, não requer procedimentos ou equipamentos especiais e, em vez disso, simplesmente instila fixação diretamente através da traqueia após a perfusão através do coração. Isso permite uma estimativa suficiente do tamanho do tumor, histologia e pontuação. Isso também permite a coleta de tecido congelado antes da fixação do tecido pulmonar. Este método é limitado na forma de não permitir quantificação morfométrica posterior do pulmão; no entanto, é mais do que suficiente para a análise de tumores pulmonares de modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs), modelos singênicos, bem como estudos de tumor xenoenxerto e metástase.
Introduction
Uma variedade de modelos de camundongos de oncogênese pulmonar e metástase de câncer para o pulmão existem que vão desde GEMMs complexos até modelos induzidos por cancerígenos até modelos sinéticos e xenoenxertos, onde as células cancerígenas são injetadas via intracardiac, intrathoracic, a veia da cauda ou outros métodos para estabelecer tumores dentro do pulmão. Todos esses modelos compartilham a necessidade comum de avaliação histológica da histologia pulmonar e da patologia. Assim, é necessário ter um método robusto, porém rápido, para realizar necropsias de camundongos enquanto perfumia os pulmões para remover o excesso de sangue, e inflar e fixar os pulmões para visualizar claramente a arquitetura pulmonar. A velocidade é um componente crítico deste procedimento, pois pode ser necessário coletar os pulmões de dezenas de ratos em um único ponto de tempo. Este procedimento pode ser realizado em menos de 6 minutos por mouse.
Embora este procedimento seja mais do que suficiente para avaliar a histologia tumoral, não é recomendado para aqueles que desejam realizar medições estereométricas ou morfômicas dos pulmões. Tais medidas exigem que a inflação pulmonar seja padronizada, assim como o cálculo da área de superfície absoluta do pulmão, volume absoluto e tamanho alveolar e número1. Este método também não é ideal para algumas abordagens de imagem. Por exemplo, a imagem dos pulmões via μCT para análise morfométrica ex vivo requer que os pulmões permaneçam preenchidos com ar2. Quando a preservação dos espaços e dimensões do ar são a principal preocupação, recomenda-se fixar os pulmões por técnicas de desidratação por perfusão3,4. Uma das maiores preocupações desse modelo é o potencial de ruptura das paredes alveolares, diminuindo seu uso em estudos de enfisema; no entanto, o procedimento recomendado para fixação de pulmões para o estudo do enfisema ainda é bastante semelhante, pois recomenda-se fixar os pulmões por instilação intratraqueal de 10% de formalina (semelhante ao protocolo descrito aqui) sob pressão constante do fluido ou por fixação in situ5.
A vantagem do procedimento descrito aqui é que ele não requer pressão constante do fluido, em vez de inflar os pulmões até que eles tenham se expandido totalmente, diminuindo assim o tempo necessário para o procedimento. O procedimento aqui descrito se assemelha muito aos métodos recomendados por um armamento da Sociedade de Patologia Toxicológica, onde um subcomitê foi formado para recomendar os melhores métodos de fixação pulmonar para estudos toxicológicos. A maioria dos cientistas deste subcomitê recomendou a fixação dos pulmões por instilação intratraqueal com uma seringa, embora houvesse recomendações variadas sobre o tempo que o pulmão foi deixado na fixação6. Assim, enquanto existe uma variedade de métodos de inflação e fixação pulmonar, o método descrito aqui é proposto para ser o método ideal para inflar rapidamente e fixar os pulmões para avaliação histológica do tumor a jusante.
Protocol
Representative Results
Discussion
O procedimento descrito acima para a perfusão, inflação e fixação de pulmões de camundongos é ideal para uma preparação rápida e eficiente dos pulmões do camundongo para histologia de tumores pulmonares e análise patologia. O procedimento não requer nenhum equipamento especial e pode ser realizado em menos de 6 minutos por mouse. O procedimento não requer um volume fixo para inflação nem pressão constante do fluido. Como este procedimento não é padronizado, não é recomendado para aqueles que desejam …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Centro Nacional de Promoção de Ciências Translacionais sob o prêmio número UL1TR003096 (MDE), National Heart, Lung, and Blood Institute Predoctoral Fellowship in Lung Diseases Training Program 5T32HL134640 (MLD).
Materials
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
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