Tümör Histolojisi için Fare Akciğerinin Perfüzyonu ve Enflasyonu
Summary
Bu yöntemin amacı, akciğer tümörü patolojisinin incelenmesi ve akciğere metastazların değerlendirilmesi için fare akciğerlerinin perfüzyonu, enflasyonu ve fiksasyonu için basit ve verimli bir yöntem sunmaktır.
Abstract
Akciğer histolojisini değerlendirme yeteneği akciğer kanseri araştırmaları ve kanser metastazı alanları için kritik öneme sahiptir. Temin edilen dokuların kalitesinden ödün vermeden çalışmalardan hızlı ve verimli bir şekilde nekropsi yapılması da aynı derecede önemlidir. Bu protokolün amacı, aşağı akış histolojik analizi için fare akciğerlerini hızla boğmak, şişirmek ve düzeltmek için bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem akciğer enflasyonuna standardize etmez; bu nedenle, herhangi bir özel prosedür veya ekipman gerektirmez ve bunun yerine kalpten perfüzyonu takiben doğrudan trakea yoluyla fiksatif aşılar. Bu, tümör büyüklüğü, histolojisi ve puanlamasının yeterli tahminini sağlar. Bu aynı zamanda akciğer dokusu fiksasyonundan önce donmuş dokunun toplanmasına izin verir. Bu yöntem, akciğerin daha sonra morfometrik niceliğine izin vermediği için sınırlıdır; ancak genetik olarak tasarlanmış fare modelleri (GEMM’ler), singeneik modellerin yanı sıra ksinograft tümör ve metastaz çalışmalarından akciğer tümörü analizi için fazlasıyla yeterlidir.
Introduction
Akciğer onkogenezi ve akciğere kanser metastazının çeşitli fare modelleri, karmaşık GEMM’lerden kanserojen kaynaklı modellere, kanser hücrelerinin intrakardiyak, intratorasik, kuyruk damarı veya akciğer içinde tümör oluşturmak için diğer yöntemlerle enjekte edildiği singeneik ve ksinograft modellerine kadar çeşitli vardır. Tüm bu modeller akciğer histolojisi ve patolojisinin histolojik değerlendirmesi için ortak ihtiyacı paylaşsa. Bu nedenle, fazla kanı çıkarmak için akciğerlere perfüzyon yaparken farelerin nekropsilerini yapmak ve akciğer mimarisini net bir şekilde görselleştirmek için akciğerleri şişirmek ve sabitlemek için sağlam ama hızlı bir yönteme sahip olmak gerekir. Hız, akciğerleri tek bir zaman noktasında düzinelerce fareden toplamak gerekebileceğinden, bu prosedürün kritik bir bileşenidir. Bu yordam fare başına 6 dakikadan daha kısa bir sürede gerçekleştirilebilir.
Bu işlem tümör histolojisini değerlendirmek için fazlasıyla yeterli olmakla birlikte, akciğerlerin stereoloji veya morfometrik ölçümlerini yapmak isteyenler için önerilmez. Bu tür ölçümler, akciğerin mutlak yüzey alanının, mutlak hacminin ve alveolar boyutunun ve1sayısının hesaplanmasında olduğu gibi akciğer enflasyonunun standartlaştırılmasını gerektirir. Bu yöntem bazı görüntüleme yaklaşımları için de en uygun değildir. Örneğin, ex vivo morfometrik analiz için akciğerlerin μCT ile görüntülenmesi, akciğerlerin hava2ile dolu kalmasını gerektirir. Hava alanlarının ve boyutlarının korunması birincil endişe kaynağı olduğunda, akciğerlerin perfüzyon dehidrasyon teknikleri ile düzeltilmesi önerilir3,4. Bu modelin en büyük endişelerinden biri, amfizem çalışmalarında kullanımını azaltarak alveolar duvarların yırtılma potansiyelidir; bununla birlikte, amfizem çalışması için akciğerlerin sabitlenmesi için önerilen prosedür hala oldukça benzerdir, çünkü akciğerlerin sürekli sıvı basıncı altında % 10 formalin intratraseral aşılama (burada açıklanan protokole benzer) veya yerinde fiksasyon5ile sabitlenmesi önerilir.
Burada açıklanan prosedürün avantajı, sürekli sıvı basıncı gerektirmemesi, bunun yerine akciğerleri tamamen genişleyene kadar şişirmesi ve böylece işlem için gereken süreyi azaltmasıdır. Burada açıklanan prosedür, toksikoloji çalışmaları için en iyi akciğer fiksasyon yöntemlerini önermek için bir alt komitenin oluşturulduğu Toksikoloji Patoloji Derneği’nin bir silahlanma armamentariumunun önerdiği yöntemlere yakından benzemektedir. Bu alt komitedeki bilim adamlarının çoğunluğu, akciğerin fiksatif6’dabırakıldığı zaman farklı öneriler olmasına rağmen, akciğerlerin bir şırınna ile intratrakial aşılama ile sabitlenmesini önerdi. Bu nedenle, akciğer şişirme ve fiksasyon çeşitli yöntemler mevcut iken, burada açıklanan yöntem hızlı bir şekilde şişirmek ve downstream tümör histolojik değerlendirme için akciğerleri düzeltmek için en uygun yöntem olarak önerilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fare akciğerlerinin perfüzyonu, enflasyonu ve fiksasyonu için yukarıda açıklanan prosedür, akciğer tümörü histolojisi ve patoloji analizi için fare akciğerlerinin hızlı ve verimli bir şekilde hazırlanması için idealdir. Prosedür herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve fare başına 6 dakikadan daha kısa bir sürede gerçekleştirilebilir. Prosedür, enflasyon veya sabit sıvı basıncı için sabit bir hacim gerektirmez. Bu işlem standart hale getirmediği için akciğerin stereolojik veya morfome…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ul1TR003096 (MDE), Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Akciğer Hastalıkları Eğitim Programı 5T32HL134640 (MLD) ödül numarası altında Ulusal Çeviri Bilimleri İlerleyen Merkez tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography. Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).
- Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. Lung fixation for the preservation of air spaces. Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).
- Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions. Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species. American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).
- Edmonds, M. D., et al. MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).
- Zhao, K., et al. Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways. PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).
