末梢血の低下に由来するT細胞に結合したPD-1遮断抗体のモニタリング
Summary
PD-1-ブロッキング抗体とT細胞への結合を評価する簡単なフローサイトメトリーアッセイを開発し、がん患者からの末梢血の滴のみを必要とする。
Abstract
PD-1遮断抗体を含む免疫チェックポイント阻害剤は、様々なタイプの癌における治療結果を有意に改善した。これらの免疫療法の薬理学的有効性は、持続的な血液濃度のために、彼らの注射の中止を超えても延長し、長期的である。ここでは、PD-1遮断抗体ニボルマブおよびペンブロリズマブのT細胞結合状態を評価する簡単なフローサイトメトリーアッセイを開発した。グルコース検査と同様に、このアッセイは末梢血を一滴だけ必要とします。T細胞上での抗体結合の可視化は、抗体血中濃度を測定するよりも信頼性が高い。また、必要に応じて、PD-1-ブロッキング抗体に結合したT細胞上の多くの特徴的な免疫関連マーカーを分析することができます。したがって、これは癌患者におけるPD-1遮断抗体の薬理学的効果を分析するための単純で低侵襲的な戦略です。
Introduction
PD-1-ブロッキング抗体は、非小細胞肺癌(NSCLC)1、2、3、4を含む様々なタイプの癌の治療のための標準的な選択肢となっている。それらは、従来の細胞傷害性化学療法に反応していない癌患者のサブセットにおいて顕著な治療効果を示す。しかし、PD-1遮断抗体を含む免疫チェックポイント阻害剤(ICI)は、免疫関連有害事象(irAE)5と呼ぶ有害事象のユニークで明確なスペクトルを引き起こす可能性がある。irAEは、ほとんどすべての組織に影響を与えることができますが、それらは、消化管、内分泌腺、皮膚、肝臓で最も一般的に観察され、それらは、掻痒、発疹、吐き気、下痢、甲状腺疾患6、7を引き起こす可能性があります。一般に、ほとんどのirAEは、ICIの開始後1〜2ヶ月以内に現れます。しかし、場合によっては、治療開始後1年より遅く、あるいは治療停止後6、7の後に発生する可能性がある。彼らはまた、他の病理から区別することが困難である可能性があり、様々な症状を引き起こします.したがって、irAEを迅速に診断し、適切に治療することは困難です。irAEはすべての組織に影響を及ぼし、その発症は循環免疫細胞、特にPD-1遮断抗体に結合したT細胞によって強く影響されます。したがって、抗体標的T細胞を監視する簡単で低侵襲的な方法は、臨床現場で重要です。
ここでは、ニボルマブやペンブロリズマブを受けたがん患者の末梢全血を一滴用にT細胞に対するPD-1遮断抗体の結合を評価する簡単な方法を開発しました。この手法を用いて、以下の各々をモニターすることができた:1)T細胞に対する抗体結合の持続時間、2)治療用抗体によるT細胞PD-1分子の占有率、および3)T細胞の活性化状態および免疫学的特徴。このメソッドは、以前に報告されたテクニック8の変更です。必要な血液量は、グルコース検査に必要な量とほぼ同じであり、このアプローチは、単核細胞の濃縮やPD-1遮断抗体との共培養を必要としません。我々は、この方法が、末梢血単核細胞(PBMCs)および胸水、心膜滲出液、気管支肺胞洗浄液、脳脊髄液の細胞を含む凍結試料を用いて行われることも確認し、この戦略が多施設研究の文脈で有用である可能性を示唆した。この方法は、irAEの早期診断を容易にし、また、それらの症状を制御し、PD-1阻害剤の後に続く治療を開始するための最適な時間を特定するための適切な免疫抑制治療を決定するのに役立つ可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、フローサイトメーターを用いて、ニボルマブ検出10用に開発した末梢血の滴下に由来するT細胞に結合したPD-1遮断抗体を検出する方法を報告する。この手法は非常に簡単で実行しやすいが、正確な結果を得るためには、2つの重要な点に留意すべきである。一つは、PD-1分子を検出するために、ニボルマブおよびペンブロリズマブと競合する適切な抗体を使用すべき?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
日本学術振興会(日本医学会KAKENHI)、日本医療研究開発機構(JP18cm0106335、19cm0106310)のS.K.への助成金による支援を行いました。
Materials
| 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
| Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
| FLOWJO | BD | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
| Mouse IgG1 monoclonal – Isotype control | abcam | ab81200 | |
| Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
| PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
| PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |
References
- Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8 (2018).
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Brahmer, J., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).
- Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
- Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
- Weber, J. S., et al. Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).
- Champiat, S., et al. Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper. Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).
- Brahmer, J. R., et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).
- Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma. Journal of Biological Methods. 6 (2), 112 (2019).
- Osa, A., et al. Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients. JCI Insight. 3 (19), 59125 (2018).
- Zelba, H., et al. Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).
- Simoni, Y., et al. Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates. Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).
- Chiu, H. H., et al. Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS. Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).
