एकल कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन और माइक्रोफ्लूइडिक क्यूपीसीआर का संयोजन: ओपिओइड निर्भरता के लिए एक सिस्टम जीव विज्ञान दृष्टिकोण
Summary
यह प्रोटोकॉल बताता है कि लेजर कैप्चर माइक्रोडिससेक्शन का उपयोग करके उच्च सटीकता और परमाणु विशिष्टता के साथ एमिग्डाला के केंद्रीय नाभिक से एकल न्यूरॉन्स, माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स को कैसे इकट्ठा किया जाए। इसके अतिरिक्त, हम इन कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्टोम के सबसेट को मापने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक आरटी-क्यूपीसीआर के उपयोग की व्याख्या करते हैं।
Abstract
शारीरिक रूप से आसन्न एकल कोशिकाओं में गहन प्रतिलेखन विषमता से पता चलता है कि सेलुलर फेनोटाइप विविधता द्वारा मजबूत ऊतक कार्यक्षमता हासिल की जा सकती है। जैविक प्रणालियों के नेटवर्क गतिशीलता की जांच करने वाले एकल-सेल प्रयोग जैविक रूप से सार्थक संकल्प पर विभिन्न स्थितियों के लिए सेलुलर और ऊतक प्रतिक्रियाओं को प्रदर्शित करते हैं। इसके साथ, हम शारीरिक रूप से विशिष्ट स्थानों से एकल कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के सबसेट को सही ढंग से मापने के लिए अपने तरीकों की व्याख्या करते हैं। हम माइक्रोफ्लूइडिक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन क्वांटिटेटिव पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) के साथ लेजर कैप्चर माइक्रोडिससेक्शन (एलसीएम) को जोड़ते हैं। हम आंत सामग्री की माइक्रोबियल बहुतायत को मापने के लिए इस माइक्रोफ्लूइडिक आरटी-क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म का भी उपयोग करते हैं।
Introduction
एकल कोशिकाओं के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल को मापने के एक ऊतक के भीतर व्यापक फेनोटाइपिक विषमता का प्रदर्शन किया है । इस जटिलता ने ऊतक समारोह को नियंत्रित करने वाले जैविक नेटवर्कों की हमारी समझ को जटिल बना दिया है। हमारे समूह और अन्य लोगों ने कई ऊतकों और शर्तों1,2,3,4,5,6में इस घटना का पता लगाया है । इन प्रयोगों से न केवल यह सुझाव है कि जीन अभिव्यक्ति नेटवर्क का नियमन ऐसी विषमता को रेखांकित करता है, बल्कि यह भी कि एकल-कोशिका संकल्प ऊतक समारोह में जटिलता का पता चलता है कि ऊतक स्तर का संकल्प सराहना करने में विफल रहता है । दरअसल, केवल कोशिकाओं के एक छोटे से अल्पसंख्यक एक विशिष्ट स्थिति या चुनौती का जवाब हो सकता है, लेकिन समग्र शरीर विज्ञान पर उन कोशिकाओं का प्रभाव काफी हो सकता है । इसके अतिरिक्त, एक सिस्टम जीव विज्ञान दृष्टिकोण जो कई सेल प्रकारों और ऊतकों से उच्च आयामी डेटासेट के लिए बहुआयामी तरीकों को लागू करता है सिस्टम-व्यापी उपचार प्रभावों को स्पष्ट कर सकता है।
हम इस तरह के डेटासेट प्राप्त करने के लिए एलसीएम और माइक्रोफ्लूइडिक आरटी-क्यूपीसीआर को जोड़ते हैं। हम फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (एफएसीएस) के माध्यम से एकल कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उनके ट्रांसपेम को मापने के लिए आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) का उपयोग करने के विपरीत यहां इस दृष्टिकोण को लेते हैं। FACS पर एलसीएम का लाभ यह है कि एकल कोशिकाओं की सटीक शारीरिक विशिष्टता को एलसीएम के साथ, अपेक्षाकृत और बिल्कुल प्रलेखित किया जा सकता है। इसके अलावा, जबकि आरएनए-सीक्यू अधिक सुविधाओं को माप सकता है कि आरटी-क्यूपीसीआर, माइक्रोफ्लूइडिक आरटी-क्यूपीसीआर कम खर्चीला है और इसमें उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता7है।
इस प्रतिनिधि प्रयोग में, हमने एमिग्डाला (सीईए) और आंत माइक्रोफ्लोरा बहुतायत4के केंद्रीय नाभिक में चूहा न्यूरोनल, माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट जीन अभिव्यक्ति पर ओपिओइड निर्भरता और नाल्ट्रेक्सोन-उपजी ओपिओइड वापसी के प्रभावों की जांच की। चार उपचार समूहों का विश्लेषण किया गया: 1) प्लेसबो, 2) मॉर्फिन, 3) नाल्ट्रेक्सोन, और 4) वापसी(चित्रा 1)। हमने पाया कि ओपिओइड निर्भरता ने जीन अभिव्यक्ति को काफी हद तक नहीं बदला, लेकिन उस ओपिओइड वापसी ने विशेष रूप से भड़काऊ जीन, टीएनएफ की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया । एस्ट्रोसाइट्स सबसे ज्यादा प्रभावित सेल टाइप थे । आंत माइक्रोबायोम ओपिओइड वापसी से गहराई से प्रभावित हुआ था जैसा कि फर्मीक्यूट्स से बैकेरॉयड अनुपात में कमी से संकेत मिलता है, जो आंत डिस्बायोसिस8,9का एक स्थापित मार्कर है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एकल सेल जीव विज्ञान सेलुलर फेनोटाइप और ऊतक समारोह की मजबूती की विषमता का प्रदर्शन किया है । इन निष्कर्षों ने मैक्रो और माइक्रो स्केल दोनों पर जैविक प्रणालियों के संगठन के बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यहां प्रस्तुत काम NIH HLB U01 HL133360 के माध्यम से जेएस और आरवी, निदा R21 DA036372 जेएस और EVB को संमानित किया, और T32 एए-007463 के समर्थन में जन Hoek को संमानित किया गया ।
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
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