Isolamento concomitante di astrociti primari e microglia per l'infezione da parassiti di Protozoi
Summary
L’obiettivo generale di questo protocollo è quello di istruire come estrarre, mantenere e dissociare le cellule di astrocite e microglia dal sistema nervoso centrale, seguite da infezione da parassiti protozoi.
Abstract
Gli astrociti e la microglia sono le cellule gliali più abbondanti. Sono responsabili del supporto fisiologico e del mantenimento dell’omeostasi nel sistema nervoso centrale (SNC). Le crescenti prove del loro coinvolgimento nel controllo delle malattie infettive giustificano l’interesse emergente per il miglioramento delle metodologie per isolare gli astrociti primari e le microglia al fine di valutare le loro risposte alle infezioni che colpiscono il SNC. Considerando l’impatto dell’infezione da Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e Toxoplasma gondii (T. gondii) nel SNC, qui forniamo un metodo per estrarre, mantenere, dissociare e infettare gli astrociti murini e le cellule di microglia con parassiti del protozoico. Le cellule estratte dalle cortice neonatali sono mantenute in vitro per 14 giorni con sostituzione periodica dei supporti differenziali. Gli astrociti e le microglie si ottengono dallo stesso protocollo di estrazione per dissociazione meccanica. Dopo la fenotipizzazione per citometria di flusso, le cellule vengono infettate da parassiti di protozoi. Il tasso di infezione è determinato dalla microscopia a fluorescenza in diversi punti temporali, consentendo così la valutazione della capacità differenziale delle cellule gliali di controllare l’invasione e la replicazione dei protozoi. Queste tecniche rappresentano metodi semplici, economici ed efficienti per studiare le risposte di astrociti e microglia alle infezioni, aprendo il campo per ulteriori analisi della neuroimmunologia.
Introduction
Il CNS è composto principalmente da neuroni e cellule gliali1,2,3. Microglia e astrociti sono le cellule glia più abbondanti nel SNC. La microglia, il macrofago residente, è l’immunocompetente e la cella glia fagocitica nel CNS3,4, mentre gli astrociti sono responsabili del mantenimento dell’omeostasi ed esercitano funzioni di supporto5.
Nonostante le cellule gliali siano classicamente note per essere responsabili del supporto e della protezione dei neuroni6,7, funzioni emergenti di queste cellule sono state descritte nella letteratura recente, comprese le loro risposte alle infezioni8,9,10,11. Quindi, c’è una spinta a sviluppare metodi per isolare queste cellule gliali per comprendere le loro funzioni individualmente.
Ci sono alcuni modelli alternativi per studiare le cellule gliali piuttosto che le colture primarie, come le linee cellulari immortalate e i modelli in vivo. Tuttavia, le cellule immortalate hanno maggiori probabilità di subire la deriva genetica e i cambiamenti morfologici, mentre gli studi in vivo impongono condizioni di manipolazione limitate. Al contrario, le colture primarie sono facili da gestire, assomigliano meglio alle cellule in vivo e ci permettono anche di controllare i fattori sperimentali12,13. Qui, descriviamo le linee guida su come estrarre, mantenere e dissociare gli astrociti murini e le cellule primarie della microglia nello stesso protocollo. Inoltre, forniamo anche esempi su come lavorare con l’infezione da protozoi in queste culture.
Le cellule del SNC estratte da topi neonatale (fino a 3 giorni) sono state coltivate per 14 giorni su supporti differenziali che consentono la crescita preferenziale di astrociti e cellule di microglia. Poiché le microglie riposano sopra gli astrociti attaccati, le popolazioni cellulari sono state dissociate meccanicamente in un’incubatrice orbitale. Successivamente, abbiamo raccolto tutti i supernatant contenenti microglia e aggiunto la prova per staccare gli astrociti. Le cellule gliali isolate sono state valutate fenotipicamente dalla citometria di flusso e placcate secondo l’esperimento desiderato.
Abbiamo anche fornito esempi su come infettare queste microglia isolate e astrociti con parassiti protozoi. T. gondii è un protozoo altamente neurotropico responsabile della toxoplasmosi14, mentre T. cruzi è responsabile della malattia di Chagas che può portare allo sviluppo di disturbi neurologici nel CNS15,16. Inoltre, è stato anche riferito che l’infezione da T. gondii17,18 o T. cruzi19,20,21 erano la presunta causa di morte nei pazienti immunocompromessi. Pertanto, il chiarimento del ruolo immunologico delle cellule gliali dal SNC nel controllo delle infezioni da protozoo è di grande importanza.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’importanza di studiare le funzioni isolate delle cellule gliali in contesti biologici distinti si è espansa negli ultimi due decenni. Comprendere il CNS al di là dei neuroni è ancora un campo in crescita nella biologia cellulare, soprattutto in infezioni o condizioni infiammatorie8,9,24. Le cellule gliali sono cruciali non solo per i neuroni supporto fisico (come era precedentemente noto), ma anche in molte altre situazioni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il professor Renato A. Mortara dell’Università Federale di San Paolo (UNIFESP) per mAb 2C2 anti-Ssp-4. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Fundao de Amparo à Pesquisa do Estado de San Paolo (FAPESP, sovvenzione 2017/25942-0 a K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient’fico e Tecnol’gico (CNPq, 402100/2016-6 a K.R.B.), Instituto Nacional de Ciància e De Vacinas (INCTV/CNPq) e Coordenao de Aperfei-oamento de Pessoal de N’vel Superior (CAPES, Codice Finanza 001). M.P.A. riceve una borsa di studio da CNPq, A.L.O.P. riceve borse di studio da CAPES, e I.S.F e L.M.F.B. riceve borse di studio da FAPESP.
Materials
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 mm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat – anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS – Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10X) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 ºC with trypsin |
References
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