固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにおける金属浸出の定量
Summary
固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて調製した試料に導入した金属を容易に定量するためのアッセイを提示する。この方法は、比色金属指標としてヒドロキシナフトールブルーを使用し、UV-Vis分光光度計を検出器として使用する。
Abstract
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)カラムから浸出した金属を含む酵素の汚染は、IMAC樹脂に使用される一般的な二価陽イオンの多くが酵素に対する阻害効果を有するので、酵素学者にとって大きな懸念事項です。しかし、金属浸出の程度と種々の溶出および還元試薬の影響は、一般的に利用可能な機器を使用するシンプルで実用的な遷移金属定量プロトコルがないため、大部分は十分に理解されていません。生化学研究室この問題に対処するために、精製工程としてIMACを用いて調製したサンプル中の金属汚染量を迅速に定量化するプロトコルを開発しました。この方法は、647nmにおけるHNBスペクトルの変化に基づいて、サンプル溶液中の金属カチオン含有量の比色指標としてヒドロキシナフトールブルー(HNB)を使用し、UV-Vis分光法を使用して、存在する金属の量を定量する手段として、ナノモル範囲に含まれる。溶液中の金属含有量は、原子吸光分光法または誘導結合プラズマ技術を使用して歴史的に決定されてきましたが、これらの方法は、典型的な生化学研究所の範囲外の特殊な機器とトレーニングを必要とします。ここで提案される方法は、生化学者が正確性を犠牲にすることなく、既存の装置と知識を使用してサンプルの金属含有量を決定するための簡単かつ迅速な方法を提供します。
Introduction
ポラスと同僚1による創業以来、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)は、Zn2+、Ni2+、Cu2+、Co2+などの遷移金属イオンと結合する能力に基づいてタンパク質を迅速に分離する方法となっています。これは、最も一般的に設計されたポリヒスチジンタグを介して行われ、現在、組換えタンパク質2の分離のための最も一般的なクロマトグラフィー精製技術の一つです。IMACはまた、食品サンプル分析3のためのキノロン、テトラサイクリン、アミノグリコシド、マクロライド、およびβラクタムを単離する方法として組換えタンパク質精製を超えるアプリケーションを発見し、肝臓および膵臓癌のための血清タンパク質マーカーを同定するステップとして4、5.当然のことながら、IMACはまた、多くの天然生物エネルギー酵素6、7、8、9、10の単離のための選択の方法となっている。しかしながら、酵素活性バイオエネルギータンパク質に関する研究のためのこれらの精製方法の成功した実施は、カラムマトリックスから溶出物に浸出した金属カチオンのごくわずかなレベルの存在に依存する。IMACで一般的に使用される二価金属陽イオンは、低濃度11、12であっても病理学的生物学的意義を知っている。これらの金属の生理学的効果は、細胞呼吸または光合成13、14、15の阻害剤として致死性を証明することができる生物エネルギー系で最も顕著である。同様の問題は、残留汚染物質金属がタンパク質の生物学的機能や生化学的および生物物理学的手法による特徴付けを妨げる可能性のあるタンパク質クラスの大半では避けられない。
酸化条件下での金属汚染のレベルとイミダゾールを溶出剤として使用することは一般的に低い16ですが、システイン還元剤(DTT、β-メルカプトエタノールなど)の存在下で行われるタンパク質分離、またはヒスチジン17、18またはエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)のようなより強いキレート剤を用いて行われるタンパク質分離は、金属汚染のはるかに高いレベルをもたらす。同様に、IMAC樹脂中の金属イオンはカルボン酸基によって頻繁に協調するため、酸性条件下で行われるタンパク質溶離物も、はるかに高いレベルの金属汚染を有する可能性が高い。溶液中の金属含有量は、ppb-ppt範囲21、22、23、24における検出限界まで原子吸光分析(AAS)および誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)を用いて評価することができる。残念ながら、AASとICP-MSは、これらの方法は、特殊な機器やトレーニングへのアクセスを必要とするので、従来の生化学ラボで検出するための現実的な手段ではありません。
Brittain25,26による以前の研究は、溶液中の遷移金属の存在を同定する方法としてヒドロキシナフトールブルー(HNB)の使用を調査した。しかし、データ20にはいくつかの内部矛盾があり、それらの作品は適切なプロトコルを提供できませんでした。Temel et al.27および Ferreiraら28による研究は、潜在的な金属指標として HNB とのブリタインの研究に拡大しました。.しかし、Temel は、HNB をキレート剤としてのみ使用して、サンプル分析に AAS を使用するプロトコルを開発しました。フェレイラの研究は、563nmにおけるHNB吸光度スペクトルの変化を用いて、pH5.7におけるHNB金属錯体のスペクトルと重なり合う自由色素HNBスペクトルの領域であり、アッセイ感受性をかなり低くし、比較的弱い金属結合親和性20をもたらした。IMACからNi 2+浸出を行うNi2+のラボの問題に対処するために、我々はブリタイン25、26、フェレリア28によって行われた作業を拡大し、いくつかの遷移金属のナノモルレベルを検出することができる簡単なアッセイを開発しました。HNBは、IMAC金属に対してニッケルおよびその他の一般的な結合を亜ナノモル結合親和性と結合し、pH値20の広い範囲にわたって1:1複合体を形成することを示した。ここで報告されるアッセイは、これらの知見に基づいており、金属定量のために647nmのHNBスペクトルの吸光度変化を利用する。このアッセイは、金属色素錯体の比色検出と定量、および金属に結合する際の遊離色素の吸光度の変化を用いて、典型的な生化学ラボで見られる一般的な緩衝液および計装を用いて生理学的pH範囲で行うことができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
HNBを用いた金属の比色検出は、IMAC樹脂からの金属イオンの遷移によるタンパク質汚染の程度を定量化する簡単な方法を提供します。Ref. 20で確立したように、Ni2+は1:1のストイチオメトリーとpHによるNi-HNB複合体の解離定数を用いてHNBに結合します。ただし、複素 Kdは、すべての推奨 (7-12) pH 値に対してサブ nM 範囲内にあります。実用的には、EDTAのような他の強力なキレート試…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この資料は、グラントMCB-1817448の下で国立科学財団によってサポートされ、トーマスFとケイトミラージェフリーズ記念信託、バンクオブアメリカ、トラスティと指定ドナーヘーゼルソープカーマンとジョージゲイカーマンからの賞によってサポートされた作品に基づいています信頼。
Materials
| 2xYT broth | Fisher Scientific | BP9743-500 | media for E.coli growth |
| HEPES, free acid | BioBasic | HB0264 | alternative buffer |
| HisPur Ni-NTA resin | Thermo Scientific | 88222 | |
| Hydroxynaphthol blue disoidum salt | Sigma-Aldrich | 219916-5g | |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | |
| Imidazole | BioBasic | IB0277 | |
| MOPS, free acid | BioBasic | MB0360 | alternative buffer |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | alternative buffer |
| Tricine | Gold Bio | T870-100 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 |
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