Immobilize Metal Affinity Kromatografisinde Metal Yıkamanın Ölçülmesi
Summary
İmmobilize metal afinite kromatografisi kullanılarak hazırlanan numunelere tanıtılan metallerin kolay ölçülmesi için bir test salıyoruz. Yöntem, kolorimetrik metal göstergesi olarak hidroksinaphthol mavisi ve dedektör olarak UV-Vis spektrofotometresi kullanır.
Abstract
IMAC reçineler kullanılan yaygın di-ve trivalent katyonların çoğu enzimler üzerinde inhibitör etkisi olduğu gibi, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) sütunlarından leached metaller ile enzimlerin kontaminasyonu, enzimler için önemli bir endişe teşkil eder. Ancak, metal yıkamanın kapsamı ve çeşitli eluting ve azaltıcı reaktiflerin etkisi, genellikle mevcut ekipmanları kullanan basit ve pratik geçiş metal kantifikasyon protokollerinin olmaması nedeniyle büyük ölçüde yeterince anlaşılamamıştır. biyokimya laboratuarları. Bu sorunu gidermek için, IMAC kullanılarak bir arınma adımı olarak hazırlanan numunelerde metal kontaminasyon miktarını hızlı bir şekilde ölçmek için bir protokol geliştirdik. Yöntem, hidroksinaphthol mavisini (HNB) numune çözeltisindeki metal katyon içeriği için kolorimetrik bir gösterge olarak ve UV-Vis spektroskopisini, 647 nm’deki HNB spektrumundaki değişikliğe bağlı olarak nanomolar aralığına, mevcut metal miktarını ölçmek için bir araç olarak kullanır. Bir çözeltideki metal içeriği tarihsel olarak atomik soğurma spektroskopisi veya endüktif olarak birleştirilmiş plazma teknikleri kullanılarak belirlenirken, bu yöntemler tipik bir biyokimya laboratuvarının kapsamı dışında özel ekipman ve eğitim gerektirir. Burada önerilen yöntem, biyokimyacıların doğruluktan ödün vermeden mevcut ekipman ve bilgileri kullanarak numunelerin metal içeriğini belirlemeleri için basit ve hızlı bir yol sağlar.
Introduction
Porath ve iş arkadaşları tarafından kuruluşundan bu yana1, immobilize metal afinite kromatografi (IMAC) hızlızn2 + gibi geçiş metal iyonları ile bağ yeteneğine dayalı proteinleri ayırmak için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir + Ni 2+, Cu2 +ve Co 2+. Bu en yaygın olarak tasarlanmış poli-histidin etiketleri ile yapılır ve şimdi rekombinant proteinlerin izolasyonu için en yaygın kromatografik arıtma tekniklerinden biridir2. IMAC ayrıca kinolonlar izole etmek için bir yol olarak rekombinant protein arıtma ötesinde uygulamalar buldu, tetrasiklinler, aminoglikozitler, makrolidler, ve gıda örnek analizi için β-laktamlar3 ve karaciğer ve pankreas kanserleri için kan-serum protein belirteçleri belirlenmesinde bir adım olarak4,5. Beklendiği gibi, IMAC da yerli biyoenerjit enzimleri6,7,8,9,10bir dizi izolasyon için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. Ancak, enzimatik olarak aktif biyoenerjik proteinler üzerinde yapılan çalışmalarda bu arınma yöntemlerinin başarılı bir şekilde uygulanması, sütun matrisinden eluate doğru leached metal katyonlar ihmal edilebilir düzeyde varlığına bağlıdır. IMAC’te yaygın olarak kullanılan divalent metal katyonlar, düşük konsantrasyonlarda bile patolojik biyolojik önemi bilinmektedir11,12. Bu metallerin fizyolojik etkisi en biyoenerjetik sistemlerde belirgindir, onlar hücresel solunum veya fotosentez inhibitörleri olarak ölümcül kanıtlayabilirim13,14,15. Kalıntı kirletici metallerin bir proteinin biyolojik işlevlerini veya biyokimyasal ve biyofiziksel tekniklerle karakterizasyonunu engelleyebildiği protein sınıflarının çoğunda benzer sorunlar kaçınılmazdır.
Oksitleyici koşullar altında metal kontaminasyon düzeyleri ve eluant olarak imidazol kullanarak genellikle düşükiken 16, protein izolasyonları sistein azaltıcı ajanlar varlığında yapılan (DTT, β-mercaptoetanol, vb) veya histidin gibi güçlü şelatörler ile17,18 veya etilendirinamintetraasetik asit (EDTA) metal kontaminasyon çok daha yüksek seviyelerde neden19,20. Benzer şekilde, IMAC reçinelerindeki metal iyonları karboksilik gruplar tarafından sıklıkla koordine edildiğinden, asidik koşullarda yapılan protein elutions da metal kontaminasyonçok daha yüksek düzeyde olması muhtemeldir. Çözeltilerde metal içeriği atomik absorpsiyon spektroskopisi (AAS) ve endüktif plazma kütle spektrometresi (ICP-MS) ppb-ppt aralığında algılama sınırına kadar bir araya gelen21,22,23,24kullanılarak değerlendirilebilir. Ne yazık ki, AAS ve ICP-MS bu yöntemler özel ekipman ve eğitim erişim gerektirecek gibi geleneksel bir biyokimya laboratuvarında algılama için gerçekçi araçlar değildir.
Brittain tarafından önceki çalışma25,26 hidroksinaphthol mavi kullanımı araştırılmış (HNB) çözeltide geçiş metallerin varlığını belirlemek için bir yol olarak. Ancak, veri20’de birkaç iç çelişki vardı ve bu çalışmalar yeterli bir protokol sunamadı. Temel ve ark.27 ve Ferreira ve ark.28’in çalışmaları Brittain’in HNB ile olan çalışmalarını potansiyel bir metal göstergesi olarak genişletti. Ancak Temel, HNB’yi sadece şelat aracı olarak kullanarak AAS’ı numune analizi için kullanan bir protokol geliştirdi. Ferreira’nın çalışmasında 563 nm de HNB emici spektrumdeğişikliği kullanılan, pH 5.7 HNB metal kompleksleri spektrumları ile ağır örtüşen serbest boya HNB spektrumbir bölge, oldukça düşük yanı sıra nispeten zayıf metal bağlama afinite20sonuçlanan. IMAC’ten Ni2+ leaching ile kendi laboratuvarımızda ki sorunları çözmek için, Brittain25,26 ve Ferreria28 tarafından yapılan çalışmaları genişleterek çeşitli geçiş metallerinin nanomolar düzeylerini tespit edebilen kolay bir teşbit geliştirdik. Biz HNB alt nanomolar bağlayıcı yakınlıkları ile IMAC metaller için nikel ve diğer ortak bağlar ve pH değerleri geniş bir yelpazede 1:1 karmaşık20. Burada bildirilen test bu bulgulara dayanmaktadır ve metal niceleme için 647 nm’de HNB spektrumundaki emici değişiklikleri kullanır. Test, tipik bir biyokimya laboratuvarında bulunan ortak tamponlar ve enstrümantasyon kullanılarak, metal boya komplekslerinin kolorimetrik tespiti ve nicelemi kullanılarak ve metale bağlandığında serbest boyanın absorbe edilmesindeki ilgili değişiklik kullanılarak fizyolojik pH aralığında yapılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
HNB kullanan metallerin kolorimetrik tespiti, IMAC reçineklerinden geçiş metal iyonları ile protein kontaminasyon derecesini ölçmek için basit bir yol sağlar. Ref. 20’de belirlediğimiz gibi, Ni2+ 1:1 stoiyometri stoiyometri stoiyometrisi ve Ni-HNB kompleksi için kopma sabiti ile HNB’ye bağlanır. Ancak, karmaşık Kd önerilen tüm (7-12) pH değerleri için alt nM aralığındadır. Pratik açıdan, edta gibi başka güçlü şelatreler mevcut olduğu sürece herhangi bir test fraksiyonl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu malzeme, Grant MCB-1817448 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen çalışma ve Thomas F. ve Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, Mütevelli ve belirtilen donör Hazel Thorpe Carman ve George Gay Carman bir ödül tarafından dayanmaktadır Güven.
Materials
| 2xYT broth | Fisher Scientific | BP9743-500 | media for E.coli growth |
| HEPES, free acid | BioBasic | HB0264 | alternative buffer |
| HisPur Ni-NTA resin | Thermo Scientific | 88222 | |
| Hydroxynaphthol blue disoidum salt | Sigma-Aldrich | 219916-5g | |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | |
| Imidazole | BioBasic | IB0277 | |
| MOPS, free acid | BioBasic | MB0360 | alternative buffer |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | alternative buffer |
| Tricine | Gold Bio | T870-100 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 |
References
- Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Block, H., et al. Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
- Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs. Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).
- Felix, K., et al. Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia. Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).
- Wu, C., et al. Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).
- Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).
- Guergova-Kuras, M., et al. Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides. Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).
- Mitchell, D. M., Gennis, R. B. Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography. FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).
- Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).
- Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).
- Louie, A. Y., Meade, T. J. Metal complexes as enzyme inhibitors. Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).
- Tamás, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation. Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).
- Gerencser, L., Maroti, P. Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues. Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).
- Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).
- Link, T. A., von Jagow, G. Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group. Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).
- Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Schäfer, F. Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy. Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).
- Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).
- Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).
- Kokhan, O., Marzolf, D. R. Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue. Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).
- Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol. Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).
- Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B., Gasser, G. . Inorganic Chemical Biology. , (2014).
- Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS. Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).
- Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS. Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).
- Brittain, H. G. Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes. Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).
- Brittain, H. G. Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue. Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).
- Temel, N. K., Sertakan, K., Gürkan, R. Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry. Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).
- Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue. Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).
- Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size. Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).
- Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).
- Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples. Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).
- Olmedo, P., et al. Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry. Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).
- Shyamal, M., et al. Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature. ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).
- Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration. Micromachines. 8 (4), 127 (2017).
- Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water. Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).
