流体デバイスと顕微鏡とフローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを越えた多孔質培地における微生物輸送を研究
Summary
画期的な曲線(BTCs)は、多孔質媒体における細菌の輸送を研究するための効率的なツールです。ここでは、マイクロコピーとフローサイトメトリックカウントと組み合わせて流体デバイスに基づくツールを紹介し、BTCsを取得します。
Abstract
多孔質媒体における微生物の輸送、分散、堆積を理解することは、流体力学、生態学、環境工学など多様なトピックからなる複雑な科学的課題です。異なる空間スケールでの多孔質環境での細菌輸送のモデリングは、細菌輸送の結果をより良く予測するために重要ですが、現在のモデルはしばしば実験室から現場の状態にスケールアップに失敗します。ここでは、2つの空間スケールで多孔質媒体での細菌輸送を研究するための実験的なツールを紹介する。これらのツールの目的は、透明多孔質マトリックスに注入された細菌の巨視的な観測(画期的な曲線や堆積プロファイルなど)を得ることにあります。小スケール(10-1000 μm)では、マイクロ流体デバイスを光学ビデオ顕微鏡と画像処理と組み合わせて画期的な曲線を得るとともに、個々の細菌細胞を細孔スケールで追跡します。より大きいスケールでは、フローサイトメトリーは、画期的な曲線を得るために、自作のロボットディスペンサーと組み合わされます。我々は、細菌が小川の低熱ゾーンのような複雑な多孔質媒体で輸送される方法をよりよく理解するためのこれらのツールの有用性を示す。これらのツールはスケールをまたいで同時に測定するので、アップスケーリングにとって非常に重要なメカニズムベースのモデルへの道を開きます。これらのツールの応用は、新しいバイオレメディエーションアプリケーションの開発に貢献するだけでなく、多孔質基質を植民地化する微生物の生態学的戦略に新たな光を当てる。
Introduction
多孔質媒体を介した微生物の輸送を理解することを目的とした研究は、主に汚染1、疾患2 の伝染およびバイオレメディエーション3の懸念によって駆動されてきた。この点に関して、細菌は主に輸送モデル4 において粒子として処理されており、バイオフィルムからの濾過、緊張、重力沈降または再動員などのプロセスが微生物5の保持または輸送の促進要因として同定されている。しかし、多孔質の風景を通して細菌の輸送を研究することは、これらの複雑な環境での成功を支える生態学的戦略についても私たちに知らせることができます。しかし、これは単一細胞、集団または微生物群集レベルで動作する新しい実験および数学的モデルを必要とする。
河川や河川の低密度帯に見られるような自然多孔質環境は、バイオフィルム形成微生物6の多様なコミュニティによって密集して植民地化されている。バイオフィルムは、流れを変え、したがって液相77,88における細菌の輸送および分散を変える構造を形成する。孔径での細菌の輸送は、多孔質マトリックスの制約された空間の可用性に依存 し、運動関連の分散は、人口密度の低い地域の資源の競争を減らすことによって個々の適性を高める効果的な方法である可能性がある。一方、モチル細菌はまた、多孔質マトリックスのより孤立した領域に到達することができ、そのような領域の拡張探査は、運動性集団10に生態学的機会を提供し得る。より大きな空間スケールでは、バイオフィルムの成長は、毛穴の(部分的な)詰まりにもつながって流路を流れ、したがって、さらにチャネライズ化および異種の流れ条件11の確立に導く。これは、栄養供給と分散容量、周波数と距離の結果を持っています。たとえば、優先的な流れは、いわゆる「高速トラック」を生成することができ、モタイル細菌は、これらのトラック12に沿った局所的な流れよりもさらに高速を達成することができる。これは、新しい生息地の探査を増やす効果的な方法です。
多孔質媒体中の可動性および非運動性細菌(および粒子)の輸送の研究のために、様々なツールが役に立つ。数値モデルは、アプリケーションにとって重要な大きな予測能力を持っていますが、多くの場合、固有の仮定4によって制限されます。実験室規模実験13,14,14を画期的曲線(BTC)モデリングと組み合わせることで、貼付効率15に対する細菌細胞表面特性の重要性に関する重要な知見を提供している。典型的には、BTCs(すなわち、一定の位置での一連の粒子濃度)は、実験装置の流出時の細胞数の定率放出および測定を介して得られる。この文脈では、BCCは多孔質マトリックス中の細菌の対流分散ダイナミクスを反映し、添付を考慮したシンク用語によって拡張することができる。しかし、BTCsのモデリングだけでは、輸送プロセスのための多孔質基質またはバイオフィルムの空間的構成の役割は解決しない。分散性や堆積プロファイルのような他の巨視的な観測可能な観測は、空間分布または保持された粒子または成長するコミュニティに関する重要な情報を提供することが証明されている。マイクロ流体は、顕微鏡,調査9、12、16、12および最近の研究910を除いて多孔質媒体の輸送を研究することを可能にする技術であり、実験系は典型的には、単一の長さの解像度スケール、すなわち孔スケールまたは全体の流体装置スケールに制約される。16
ここでは、異なるスケールで多孔質の風景の中でのモチル菌と非運動性細菌の輸送を研究するための組み合わせ方法のスイートを紹介します。我々は、BTC分析を用いて、孔径での細菌輸送の観測と、より大きなスケールでの情報を組み合わせたものである。ポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いたソフトリソグラフィーから構築された微小流体デバイスは、生体適合性、化学薬品の範囲に耐性、低コストで複製可能、優れた光学透過性と微視的観察に不可欠な低い自己蛍光を提供します。PDMSに基づくマイクロ流体は、これまで、単純なチャネル17 またはより複雑な幾何学12における微生物の輸送を研究するために使用されてきた。しかし、一般的にマイクロ流体実験は、短期的な地平線に焦点を当て、生きている細胞のエピ蛍光顕微鏡観察は、一般的に遺伝子組み換え株(例えば、GFPタグ付き株)に限定される。ここでは、PDMSベースのマイクロ流体デバイスを、フローサイトメトリーと組み合わせてポリ(メチルメタクリル酸メチルメタクリル酸塩)(PMMA、プレキシガラスとも呼ばれる)から製造された大型デバイスと組み合わせて、細菌輸送を研究するツールを紹介します。PDMSとPMMAはガス透過性と表面特性が異なるため、細菌輸送を研究する補完的な機会を提供します。マイクロ流体デバイスはより制御された環境を提供する一方で、より大きなデバイスは長期間にわたる実験を可能にするか、自然細菌群集を使用することができます。専用領域での高い時間分解能での顕微鏡計数は、PDMSベースのマイクロ流体デバイスでBTCを得るために使用される。PMMAベースのデバイスからBTCモデリング用のセルカウントを得るために、フローサイトメトリーと組み合わせた自己構築自動液体ディスペンサーを導入します。この設定では、細胞は流体装置を通過し、連続して96ウェルプレートに分配されます。時間分解能は、正確に分配できる最小体積と、流体デバイスを通る中流量によって制限されます。ウェル内の固定は成長を防ぎ、下流のフローサイトメトリック列挙のためのDNA染色を促進する。輸送実験中の細菌の増殖を防ぐために、我々は最小限の培地(運動バッファーと呼ばれています)を使用します。
異なるスケールでの流体デバイスの調製のためのプロトコルが容易に利用可能であるため、我々は簡単にそのようなデバイスを生成するための技術を導入し、むしろ、BTCsを記録するための実験的な手順に焦点を当てています。同様に、微生物のフローサイトメトリック列挙に対して様々なルーチンが存在し、ユーザーはフローサイトメトリーによって得られた結果を解釈するための専門的な知識を必要とします。微小流体デバイスの新しい使用と顕微鏡イメージングを組み合わせて、蛍光タグ付き細胞のBTCを記録することを報告します。細孔スケールでは、局所的な速度と軌道は画像処理によって得られます。また、PMMAベースの流体デバイスをフローサイトメトリックカウントと組み合わせて使用し、天然の流れバイオフィルムによって植民地化された多孔質環境におけるモチル細胞および非モタイル細胞の細菌輸送を観察することを実証する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、単一細胞レベルと人口レベルで多孔質系を介した微生物の輸送を研究する2つの手段を提案する。BTCモデリングを用いた輸送現象の研究は、生態系規模での病原体や汚染物質の拡散に関する貴重な洞察を提供してきましたが、実験室での実験から現場条件へのスケールの困難は依然として存在しています。ここで説明するツールは、多孔質環境での輸送に関連する微生物の生態学的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ロボットディスペンサーとdispenser.pyスクリプトのセットアップでアントワーヌ・ウィードマーの助けを認めます。
Materials
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
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