Het combineren van fluidic devices met microscopie en flow cytometrie om microbiële transporten te bestuderen in poreuze media over ruimtelijke schalen
Summary
Baanbrekende krommen (BBC’s) zijn efficiënte instrumenten om het transport van bacteriën in poreuze media te bestuderen. Hier introduceren we tools op basis van vloeibare apparaten in combinatie met microscopie en flow cytometrische tellingen om BTC’s te verkrijgen.
Abstract
Inzicht in het vervoer, de verspreiding en depositie van micro-organismen in poreuze media is een complexe wetenschappelijke taak die onderwerpen omvat die zo divers zijn als hydrodynamica, ecologie en milieutechniek. Het modelleren van bacterieel transport in poreuze omgevingen op verschillende ruimtelijke schalen is van cruciaal belang om de gevolgen van bacterieel vervoer beter te voorspellen, maar de huidige modellen slagen er vaak niet in om van laboratorium naar veldomstandigheden te worden opgeschaald. Hier introduceren we experimentele tools om bacterieel transport in poreuze media op twee ruimtelijke schalen te bestuderen. Het doel van deze instrumenten is om macroscopische observables (zoals doorbraakkrommen of afzettingsprofielen) van bacteriën geïnjecteerd in transparante poreuze matrices te verkrijgen. Op kleine schaal (10-1000 μm) worden microfluïde apparaten gecombineerd met optische videomicroscopie en beeldverwerking om baanbrekende krommen te verkrijgen en tegelijkertijd individuele bacteriële cellen op de porieschaal te volgen. Op grotere schaal wordt flow cytometrie gecombineerd met een zelfgemaakte robotdispenser om baanbrekende rondingen te verkrijgen. We illustreren het nut van deze hulpmiddelen om beter te begrijpen hoe bacteriën worden vervoerd in complexe poreuze media, zoals de hyporheïsche zone van stromen. Aangezien deze tools gelijktijdige metingen bieden op verschillende schalen, maken ze de weg vrij voor op mechanismen gebaseerde modellen, die van cruciaal belang zijn voor opschaling. Toepassing van deze instrumenten kan niet alleen bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe bioremediatietoepassingen, maar ook nieuw licht werpen op de ecologische strategieën van micro-organismen die poreuze substraten koloniseren.
Introduction
Studies die gericht zijn op het begrijpen van het vervoer van microben via poreuze media zijn voornamelijk veroorzaakt door bezorgdheid over besmetting1, de overdracht van ziekte2 en bioremediatie3. In dit verband zijn bacteriën meestal behandeld als deeltjes in transportmodellen4 en zijn processen zoals filtratie, overbelasting, gravitatieregeling of hermobilisatie van biofilms geïdentificeerd als aanjagers van retentie of transport van microben5. Het bestuderen van het transport van bacteriën door poreuze landschappen kan ons echter ook informeren over de ecologische strategieën die hun succes in deze complexe omgevingen ondersteunen. Toch vereist dit nieuwe experimenten en wiskundige modellen die werken op het niveau van één cel, populatie of microbiële gemeenschap.
Natuurlijke poreuze omgevingen, zoals die gevonden in de hyporheïsche zone van beken en rivieren, zijn dicht gekoloniseerd door diverse gemeenschappen van biofilm-vormende microben6. Biofilms vormen structuren die de stroom wijzigen en dus het transport en de verspreiding van bacteriën in de vloeibare fase7,8. Het vervoer van bacteriën op porieschaal hangt af van de beperkte beschikbaarheid van ruimte in de poreuze matrix en beweeglijkheidsgerelateerde verspreiding kan een effectieve manier zijn om de individuele geschiktheid te vergroten door verminderde concurrentie om hulpbronnen in minder dichtbevolkte gebieden. Aan de andere kant kunnen motilebacteriën ook meer geïsoleerde gebieden van de poreuze matrix bereiken en de uitgebreide verkenning van dergelijke gebieden kan ecologische mogelijkheden bieden om motile populaties10. Bij grotere ruimtelijke schalen leidt biofilmgroei de stroompaden af die ook leiden tot (gedeeltelijke) verstopping van poriën en dus tot de vaststelling van nog meer gekanaliseerde en heterogene stromingsvoorwaarden11. Dit heeft gevolgen voor de toevoer van voedingsstoffen en de verspreidingscapaciteit, de frequentie en de afstand. Preferentiële stroom, bijvoorbeeld, kan genereren zogenaamde “fast-tracks” en motile bacteriën kunnen bereiken nog hogere snelheden dan de lokale stroom langs deze tracks12. Dit is een effectieve manier om de verkenning van nieuwe habitats te verhogen.
Een verscheidenheid van instrumenten maken gebruik voor de studie van het vervoer van motile en niet-motile bacteriën (en deeltjes) in poreuze media. Numerieke modellen hebben grote voorspellende capaciteiten die belangrijk zijn voor toepassingen, maar worden vaak beperkt door inherente aannames4. Laboratoriumexperimenten13,14 in combinatie met baanbrekende curve (BTC) modellering hebben belangrijke inzichten opgeleverd in het belang van bacteriële celoppervlakeigenschappen voor het vasthouden van efficiëntie15. BBC’s (d.w.z. tijden reeks deeltjesconcentratie op een vaste locatie) worden meestal verkregen via constantere emissies en meting van celnummers bij de uitstroom van het experimentele apparaat. In deze context weerspiegelen BTC’s de advection-dispersiedynamiek van bacteriën in de poreuze matrix en kunnen ze worden verlengd met een gootsteenterm die waarde hechting. Het modelleren van BBC’s alleen lost echter niet de rol op van de ruimtelijke organisatie van het poreuze substraat of biofilm voor transportprocessen. Andere macroscopische waarneembare stoffen zoals dispersiviteit of afzettingsprofielen hebben bewezen belangrijke informatie te verschaffen over de ruimtelijke verdeling of de behouden deeltjes of groeiende gemeenschappen. Microfluidics is een technologie die het mogelijk maakt het bestuderen van transport in poreuze media door microscopie onderzoek9,12,16, en met uitzondering van een recent werk10, experimentele systemen zijn meestal beperkt tot een enkele lengte schaal van resolutie, dat wil zeggen, de porie schaal of de gehele vloeistofapparaat schaal.
Hier introduceren we een reeks gecombineerde methoden om het transport van motile- en niet-motilebacteriën in poreuze landschappen op verschillende schalen te bestuderen. We combineren waarnemingen van bacterieel transport op de porieschaal met informatie op grotere schaal, door middel van BTC-analyse. Microfluïde apparaten die zijn opgebouwd uit zachte lithografie met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) zijn biocompatibel, bestand tegen een reeks chemicaliën, maken replicabiliteit tegen lage kosten mogelijk en bieden een uitstekende optische transparantie en een lage autofluorescentie die cruciaal is voor microscopische observatie. Microfluidics op basis van PDMS is eerder gebruikt om het transport van microben in eenvoudige kanalen17 of in complexere geometrieën te bestuderen12. Echter, meestal microfluidics experimenten richten zich op korte termijn horizonten en epi-fluorescentie microscopische observatie van levende cellen is vaak beperkt tot genetisch gemodificeerde stammen (bijvoorbeeld, GFP-gelabelde stammen). Hier presenteren we tools om bacterieel transport te bestuderen met behulp van PDMS-gebaseerde microfluïde apparaten in combinatie met microscopie en grotere apparaten vervaardigd uit poly (methylmethacrylaat) (PMMA, ook bekend als plexiglas) in combinatie met flow cytometrie. PDMS en PMMA verschillen in gaspermeabiliteit en oppervlakte-eigenschappen, waardoor complementaire mogelijkheden zijn om bacterieel transport te bestuderen. Terwijl het microfluidic apparaat een gecontroleerdere omgeving verstrekt, staat het grotere apparaat voor experimenten over langere periodes van tijd of gebruikend natuurlijke bacteriële gemeenschappen toe. Microscopie tellen op hoge temporele resolutie in een specifiek gebied wordt gebruikt om BTC te verkrijgen in de PDMS-gebaseerde microfluïde apparaat. Om celtellingen voor BTC-modellering te verkrijgen van het OP PMMA gebaseerde apparaat, introduceren we een zelfgebouwde geautomatiseerde vloeistofdispenser in combinatie met stroomcytometrie. In deze opstelling passeren cellen het vloeibare apparaat en worden achtereenvolgens in 96 putplaten afgegeven. De temporele resolutie wordt beperkt door het minimumvolume dat nauwkeurig kan worden afgegeven en dus de gemiddelde stroomsnelheid door het vloeibare apparaat. Fixatief in de putten voorkomt groei en vergemakkelijkt DNA-kleuring voor downstream flow-cytometrische opsoming. Om bacteriële groei tijdens transportexperimenten te voorkomen gebruiken we een minimaal medium (begroeide beweeglijkheidsbuffer).
Aangezien protocollen voor de bereiding van vloeistofapparaten op verschillende schalen direct beschikbaar zijn, introduceren we slechts kort de technieken om dergelijke apparaten te produceren en richten we ons eerder op de experimentele procedures om BBC’s op te nemen. Op dezelfde manier bestaan er verschillende routines voor de stromingscytometrische opsoming van microben en gebruikers vereisen deskundige kennis om resultaten te interpreteren die zijn verkregen door flow cytometrie. We rapporteren het nieuwe gebruik van microfluïde apparaten in combinatie met microscopische beeldvorming om BTC’s van fluorescerend getagde cellen vast te leggen. Op de porieschaal worden lokale snelheden en trajecten verkregen door middel van beeldverwerking. Verder tonen we het gebruik van een PMMA-gebaseerde fluidic apparaat in combinatie met flow-cytometrische tellen om bacteriële transport van motile en niet-motile cellen in poreuze omgevingen gekoloniseerd door een native stream biofilm te observeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen we twee middelen voor om het vervoer van microben door poreuze systemen op eencellig en populatieniveau te bestuderen. Hoewel de studie van transportverschijnselen met BTC-modellering waardevolle inzichten heeft opgeleverd in de verspreiding van ziekteverwekkers of verontreinigingen op de ecosysteemschalen, bestaan er nog steeds moeilijkheden om te variëren van laboratoriumexperimenten tot veldomstandigheden. De hier beschreven tools stellen onderzoekers in staat om de ruimtelijke en temporele schalen exper…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen de hulp van Antoine Wiedmer met de opstelling van de robotdispenser en het dispenser.py script.
Materials
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
- Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review. Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. Processes in microbial transport in the natural subsurface. Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).
- Tufenkji, N. Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).
- Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media. Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).
- Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. The ISME Journal. 1, (2019).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale. Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).
- Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review. Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).
- Creppy, A., Clément, E., Douarche, C., D’Angelo, M. V., Auradou, H. Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium. Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).
- Camesano, T. A., Logan, B. E. Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media. Environmental Science & Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).
- Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand. Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).
- Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).
- Long, T., Ford, R. M. Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor. Environmental Science & Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13. Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).
