암세포에 의한 자연살해(NK) 세포 매개 박멸의 회피는 암 개시 및 진행에 중요하다. 여기에서, 우리는 간 종양 세포를 향해 NK 세포 매개 세포 독성을 평가하기 위하여 2개의 비 방사능 기지를 둔 프로토콜을 제시합니다. 또한 NK 세포 마이그레이션을 분석하기 위해 세 번째 프로토콜이 제시됩니다.
자연 살인자 (NK) 세포는 선천적인 면역 계통의 세포 독성 림프구 집단의 하위 집합이며 병원체감염, 악성 및 스트레스 세포를 제거하여 첫 번째 방어선으로 참여합니다. 암세포를 근절하는 NK 세포의 능력은 암과의 싸움에서 중요한 도구입니다. 몇몇 새로운 면역 기지를 둔 치료는 NK 세포 활동을 강화하거나 NK 세포 매개 박멸에 암세포의 감도를 증가에 의지하는 암 처리를 위한 조사되고 있습니다. 그러나, 이러한 치료 접근법을 효과적으로 개발하기 위해서는, NK 세포 매개 세포 독성 및 이동을 모니터링하기 위한 비용 효율적인 시험관내 세포학적 측정법도 필요하다. 여기에서, 우리는 암세포 (또는 그밖 표적 세포)에 NK 세포 세포 독성의 효력을 믿을 수 있고 재현가능하게 감시할 수 있는 2개의 시험관 내 프로토콜을 제출합니다. 이러한 프로토콜은 비방사능 기반이며 설정이 간편하며 처리량이 높은 스크리닝을 위해 확장할 수 있습니다. 또한 NK 세포 이동을 정량적으로 모니터링하는 유세포분석 기반 프로토콜을 제시하며, 이는 높은 처리량 스크리닝을 위해 확장할 수도 있습니다. 집합적으로, 이 3개의 프로토콜은 역기능 표적 세포를 근절하는 세포의 기능에 필요한 NK 세포 활동의 중요한 양상을 감시하기 위하여 이용될 수 있습니다.
인체가 비자아를 식별하고 이물질을 박멸하는 능력은 병원균과 악성 종양에 대한 인간의 생존의 핵심입니다1. 인간의 면역 반응은 이 과정에서 가장 중요한 역할을 한다2,3,4. 주요 특성 및 기능에 따라, 인간의 면역 체계는 크게 두 가지 주요 기능 그룹으로 분류 될 수 있습니다: 적응 면역 체계와 타고난 면역 시스템. 적응면역계통은 전형적으로 주어진 병원체에 특이적이며 면역학적 기억을 가지며, 따라서, 동일한 병원체5,6,7,8,9에의한 미래의 재감염에 오래 지속되고 반응한다. 대조적으로, 선천적인 면역은 그것의 표적 박멸에 있는 훨씬 더 넓고 상대적으로 비특이적입니다. 따라서, 전형적으로, 선천적인 면역 반응은 면역학적방어(10)의제1 라인으로서 역할을 한다. 자연살인자(NK) 세포는 선천적인 면역계통에 속하며 총 순환 림프구11의10-15%를 나타낸다. NK 세포는 2개의 중요한 기계장치를 통해 표적 세포를 근절합니다. 먼저, 활성화 리간드를 발현하는 표적 세포에 결합하면, NK 세포는 표적 세포12,13,14,15에서공동으로 세포사멸을 유도하는 외신세포증을 통해 막 파괴 단백질 퍼포린 및 세린 프로테아제 화강암을 방출한다. 부가적으로, 파슬 및 종양 괴사 인자 관련 세포자멸 유도 리간드(TRAIL)를 발현하는 NK 세포는 사멸 수용체(Fas/CD95)를 발현하는표적 세포와 상호작용하여 카스파제 의존적 세포사멸(16)을 유도한다. 가장 중요한 것은, NK 세포는 병원균-감염 또는 악성 세포를 근절하기 위해 항원 프리젠테이션과 같은 전자극을 필요로 하지 않는다; 따라서, 그들은 일반적으로 준비 – 투 – 킬 상태17,18에있습니다 . 종양 발달과 진행을 억제하고 암세포를 근절하기 위해 NK 세포는 종양 부위로 이동하고 종양 미세 환경에서 한 번 표적 세포를 식별하고 공격해야합니다.
과거에는 NK 세포 이펙터 기능이 주로 탈과립 및 세포독성 에 의해모니터링되었고, 19,20,21. NK 세포 세포 독성은 또한 51크롬 방출 분석술22,23,24,25에의해 측정될 수 있다. 그러나, 이러한 분석법은 감마 카운터의 필요성을 포함하여 몇 가지 특정 요건을 가지고 있으며, 방사성 물질의 취급 및 폐기에 대한 교육을 필요로 하며 사용자에게 위험 수준을 제기하는 방사능 기반이다. 따라서, 몇몇 새로운 비방사선작용제 는 NK 세포 활동을 공부하기 위하여 개발되고 채택되었습니다.
여기서, 우리는 NK 세포 매개 암 세포 박멸을 측정하는 두 가지 프로토콜, 착색 젖산 탈수소 효소 (LDH) 측정 기반 NK 세포 매개 세포 독성 분석 및 칼세인 아세톡시 메틸 (AM) 염색 계 현미경 방법을 설명합니다. 이 측정법은 방사성 동위원소의 사용을 요구하지 않으며, 간단하고 민감하며, NK 세포 기능을 조절하는 요인을 재현가능하게 식별합니다. 추가적으로, NK 세포 기능은 NK 세포 이동에 있는 변경을 감시하지 않고 완전히 평가될 수 없기 때문에, 우리는 또한 NK 세포 이동을 감시하기 위하여 유세포 측정 기지를 둔 정량적인 방법을 제시합니다.
여기에서 기술된 세포 독성 및 이동 방법은 악성 종양에서 암세포 및 NK 세포 매개 면역 회피 메커니즘에 대한 NK 세포 세포 독성을 평가하고 NK 세포 활성/기능을 향상시키는 치료제를 식별하는 데 사용될 수 있다. 프로토콜은 고전 적 방사능 기반 51크롬 방출 분석에 대한 간단하고 민감하며 재현 가능하며 바람직한 대안입니다. 이 프로토콜은 해석하기 쉬운 간단한 색채, 현미경 또는 FACS 기반 판독값을 통해 대부분의 실험실에서 사용하기에 쉽게 적응할 수 있도록 특별히 설계되었으며, 연구자들이 신뢰할 수 있는 결론에 도달할 수 있도록 합니다. 모두 높은 처리량 스크리닝 기반 접근 방식에 대해 확장 가능합니다. 프로토콜은 단 하나 간 종양 세포주의 맥락에서 제출되더라도, 그밖 암 세포 모형 및/또는 그밖 비암 표적 세포에 쉽게 적응될 수 있습니다.
제시된 모든 방법은 견고하고 재현 가능한 반면, 실험간 변이는 암세포와 NK 세포의 다른 배치로 발생할 수 있습니다. 결과가 실험의 결론을 정확하게 뒷받침할 수 있도록 생물학적 삼각을 사용하여 적어도 두 번 실험을 반복하는 것이 좋습니다.
이 방법의 한계는 NK92MI 세포의 성장 속도가 느려질 수 있다는 것입니다. 따라서 50개 이상의 샘플을 대상으로 한 실험의 경우 지연을 방지하기 위해 충분한 수의 NK92MI를 미리 재배해야 합니다. 또한 프로토콜에 설명된 모든 컨트롤은 가짜 및 재현불가능한 결과를 피하기 위해 구현되어야 합니다. NK 세포독성 분석의 또 다른 한계는 NK 대 암세포 비, 배양 시간뿐만 아니라, 각 표적 세포에 대해 최적화되어야 한다는 것이다. 예를 들어, 우리는 간암 세포주뿐만 아니라 여러 배양 시간 (2, 3, 4, 5, 6 시간)에 대한 NK 세포 (1 :5, 1 :10, 1 :20, 1 : 20, 1 : 40 및 1 :80)에 대한 암 세포의 다양한 비율을 테스트했습니다. 우리의 결과에 근거하여 우리는 NK 세포에 암세포의 1:10 및 1:20 비율과 3 시간 동안 배양으로 가장 일관된 결과를 관찰했습니다.
또한, 고형 종양으로부터 유래된 암세포는 배양판의 표면에 부착되고 성장하는 반면, NK 세포는 현탁액에서 성장한다. 배양 시간이 3 h보다 길면 초저 부착 96 웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 또한 NK 세포 유도 세포 독성 실험은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 분리 된 기본 NK 세포를 사용하여 수행 될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 이러한 실험에는 몇 가지 제한사항이 있습니다. 첫째, 이러한 실험은 NK92MI 세포와 마찬가지로 쉽게 스케일링될 수 없습니다. 둘째, PMBC로부터 분리된 NK 세포의 세포독성 활성의 배치-배치 변이는 결과의 재현성 및 해석측면에서 문제가 될 수 있다. 유사하게, 다른 인간 NK 세포주들은 문헌에 기재되어 있으며, NKL세포(29)를포함하는 이러한 유형의 실험에 사용될 수 있다; 그러나, NK-92MI 세포와는 달리, NKL 세포는 IL-2 의존적이며 시판되지 않는다.
설명된 calcein AM 실험을 고려할 때, 칼세인 AM이 세포 사멸 후 세포 사멸 체에 남아 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다30. 따라서, 칼세인 AM 염색의 정량은 NK 세포 독성의 과소 평가로 이어질 수 있으므로 신중하게 수행되어야한다.
NK 세포 매개 세포 독성과 유사하게, 사이토카인 및 기타 화학유고력에 의한 NK 세포 이동의 변조는 NK 세포 기능의 조절에 중요한 역할을 한다. 여기서 설명된 NK 세포 이동 분석법은 케모카인 또는 화학유고력과 같은 자극의 맥락에서 NK 세포 이동을 평가하는 간단한 플랫폼을 제공한다. 이 분석은 NK 세포 이동을 촉진하거나 방해할 수 있는 제제를 평가하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 NK 세포 이동의 강화제 및 억압자를 식별한다. 이 방법은 또한 유전/후생유전학 변경 (upregulation 또는 downregulation) 또는 약물 처리 때문에 발생의 결과로 NK 세포 이동 조절 능력을 공부하는 데 유용 할 수 있습니다.
NK 세포 마이그레이션을 정확하게 측정하기 위해 따라야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 컨디셔닝 된 매체를 사용하는 모든 실험의 경우, 정확한 측정을 얻기 위해 대조군 및 처리 조건 모두에서 동등한 컨디셔닝 배지를 사용하는 것이 중요합니다. 배양 시간은 정제 된 화학 물질 및 컨디셔닝 된 배지로 다양합니다. 마지막으로, 트랜스웰 이동 성 평가는 잘 확립되고 NK 세포 이동을 평가하는 훌륭한 방법으로 간주됩니다. 그러나, 계산서에서 채택된 동종 단균 배양은 종양 미세 환경을 더 정확하게 모방할 지도 모르다 조직 또는 3D 문화의 복잡한 생리학 부족합니다.
따라서, 이 문서에서 제시된 NK 세포 세포 세포 독성 분석및 NK 이동 분석실험에 몇 가지 한계가 있지만, 이러한 분석법은 광범위한 면역학적 연구에 적용가능하며 따라서 NK 세포를 평가하기 위한 중요하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다. 기능 및 NK 세포 변조 면역 치료제.
The authors have nothing to disclose.
우리는 감사하게 건강의 국가 학회에서 보조금을 인정: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW), 및 1R01 CA218008-01A1 (NW). 우리는 또한 NW에 W81XWH1910480 및 W81XWH-18-1-0069를 자금 조달 국방부를 인정합니다.
Absolute counting beads | Thermo Fisher Scientific | C36950 | |
Alpha-MEM | Sigma-Aldrich | M4256 | |
Amicon ultra Centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
Calcein AM dye | Sigma-Aldrich | 17783 | |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | |
Folic Acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
Horse Serum | Gibco | 16050114 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 2530081 | |
LDH cytotoxic assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
NK92MI cells | ATCC | CRL-2408 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
SKHEP-1 Cells | ATCC | HTB-52 | |
Transwell permeable chambers | Costar | 3241 | |
Trypsin EDTA solution | Gibco | 25200056 |