Undandragande av naturliga mördare (NK) cellmedierad utrotning av cancerceller är viktigt för cancerinitiering och progression. Här presenterar vi två icke-radioaktivitetsbaserade protokoll för att utvärdera NK cellmedierad cytotoxicitet mot levertumörceller. Dessutom presenteras ett tredje protokoll för att analysera NK-cellmigrering.
Naturliga killer (NK) celler är en delmängd av cytotoxiska lymfocyter befolkningen i det medfödda immunsystemet och delta som en första försvarslinje genom att rensa patogen-infekterade, maligna och stressade celler. NK-cellers förmåga att utrota cancerceller gör dem till ett viktigt verktyg i kampen mot cancer. Flera nya immunbaserade terapier är under utredning för cancerbehandling som är beroende av antingen på att förbättra NK-cellaktivitet eller öka cancercellernas känslighet för NK-cellmedierad utrotning. För att effektivt utveckla dessa terapeutiska metoder behövs dock också kostnadseffektiva in vitro-analyser för att övervaka NK-cellmedierad cytotoxicitet och migration. Här presenterar vi två in vitro-protokoll som tillförlitligt och reproducerbart kan övervaka effekten av NK-cells cytotoxicitet på cancerceller (eller andra målceller). Dessa protokoll är icke-radioaktivitet-baserade, enkla att ställa in, och kan skalas upp för hög genomströmning screening. Vi presenterar också ett flöde cytometri-baserade protokoll för att kvantitativt övervaka NK cell migration, som också kan skalas upp för hög genomströmning screening. Tillsammans kan dessa tre protokoll användas för att övervaka viktiga aspekter av NK cellaktivitet som är nödvändiga för cellernas förmåga att utrota dysfunktionella målceller.
Människokroppens förmåga att identifiera icke-själv och utrota främmande föremål är nyckeln till människans överlevnad mot patogener och maligniteter1. Den mänskliga immunsvar spelar den viktigaste rollen i denna process2,3,4. Baserat på viktiga egenskaper och funktioner, kan det mänskliga immunsystemet i stort sett klassificeras i två stora funktionella grupper: adaptivt immunförsvar och det medfödda immunsystemet. Det adaptiva immunsystemet är vanligtvis specifikt för en viss patogen och har immunologiskt minne och därmed är långvarig och lyhörd för framtida återinfektion av samma patogen5,6,7,8,9. Medfödd immunitet är däremot mycket bredare i sin målutrotning och relativt ospecifik. Därför, typiskt, den medfödda immunsvar fungerar som den första raden av immunologiskt försvar10. Naturliga killer (NK) celler tillhör det medfödda immunsystemet och representerar 10−15% av den totala cirkulerande lymfocyter11. NK-celler utrotar målceller via två viktiga mekanismer. Först, vid bindning för att rikta celler som uttrycker aktivera nde ligands, NK celler släppa membran-störande protein perforin och serin proteas granzymes genom exocytosis, som gemensamt inducerar apoptos i målceller12,13,14,15. Dessutom, NK celler uttrycker FasL och tumör nekros faktor-relaterade apoptos-inducerande ligand (TRAIL) interagera med målceller uttrycker död receptorer (Fas /CD95), vilket leder till caspase-beroende apoptos16. Viktigast av allt, NK celler kräver inte prestimulation, såsom antigen presentation, för att utrota patogen-infekterade eller maligna celler; Således är de oftast i en ready-to-kill stat17,18. För att hämma tumörutveckling och progression och utrota cancerceller måste NK-celler migrera till tumörplatsen och, en gång i tumörmikromiljön, identifiera och attackera målcellerna.
Tidigare övervakades NK-cellseffektorfunktionerna huvudsakligen av degranulation och cytotoxicitetsanalyser19,20,21. NK cell cytotoxicitet kan också mätas med 51krom release analys22,23,24,25. Denna analys har dock vissa specifika krav, bland annat behovet av en gammadisk, och är radioaktivitetsbaserad, som kräver utbildning i hantering och bortskaffande av radioaktiva material och utgör en risknivå för användaren. Därför har flera nya icke-radioaktivitetsbaserade analyser utvecklats och använts för att studera NK-cellaktivitet.
Här beskriver vi två sådana protokoll, kolorimetrisk mjölkväteas (LDH) mätbaserad NK cellmedierad cytotoxicitetsanalys och calcein acetoxymethyl (AM) färgningsbaserad mikroskopisk metod för att mäta NK cellmedierad cancercellutrotning. Dessa analyser kräver inte användning av radioisotoper, är enkla, känsliga och reproducerbart identifiera faktorer som modulerar NK-cellfunktion. Dessutom, eftersom NK-cellfunktionen inte kan utvärderas helt utan att övervaka förändringar i NK-cellmigreringen, presenterar vi också en flödescytometribaserad kvantitativ metod för att övervaka NK-cellmigrering.
De cytotoxicitets- och migreringsmetoder som beskrivs här kan användas för att utvärdera NK-cellcytotoxicitet till cancerceller och NK-cellmedierade mekanismer för immunundandragande i maligna tumörer, samt för att identifiera terapeutiska medel som kommer att förbättra NK-cellaktivitet/funktion. Protokollen är enkla, känsliga, reproducerbara och föredragna alternativ till klassisk radioaktivitetbaserad 51krom release analys. Protokollen har utformats speciellt för att vara lätt anpassningsbara för användning i de flesta laboratorier, med enkel kolorimetrisk, mikroskopisk eller FACS-baserade avläsningar som är lätta att tolka, så att forskare kan nå tillförlitliga slutsatser. Alla är skalbara för screeningbaserade metoder med hög genomströmning. Även om protokollen presenteras i samband med en enda levertumörcellinje, kan de enkelt anpassas enkelt till andra cancercelltyper och/eller andra målceller som inte är cancer.
Medan alla metoder som presenteras är robusta och reproducerbara, kan interexperimentell variation uppstå med olika partier av cancerceller och NK-celler. För att säkerställa att resultaten korrekt stöder slutsatserna av experimenten är det lämpligt att upprepa experimentet minst två gånger med hjälp av biologiska triplicates.
En begränsning av denna metod är att tillväxten av NK92MI celler kan vara långsam. För experiment med 50 eller fler prover bör därför tillräckligt många NK92MI odlas i förväg för att förhindra förseningar. Dessutom måste alla kontroller som beskrivs i protokollen genomföras för att undvika falska och icke reproducerbara resultat. En annan begränsning av NK cytotoxicitet analys är att NK till cancer cellförhållandet, liksom inkubationstiden, måste optimeras för varje målcell. Till exempel har vi testat olika förhållanden i cancerceller till NK-celler (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 och 1:80) för levercancer cellinjer, samt flera inkubationstider (2, 3, 4, 5 och 6 h). Baserat på våra resultat observerade vi mest konsekventa resultat med 1:10 och 1:20 nyckeltal av cancerceller till NK-celler och inkubationsinför 3 h.
Dessutom kommer cancerceller som härrör från fasta tumörer att fästa och växa på ytan av odlingsplattan, medan NK-celler växer i suspension. Om inkubationstiden är längre än 3 h, är det lämpligt att använda ultralow fastsättning 96 brunnplattor, vilket kommer att förbättra konsistensoch reproducerbarhet mellan experiment och biologiska replikat. Det är också viktigt att notera att NK cell-inducerad cytotoxicitet analyser kan också utföras med hjälp av primära NK-celler isolerade från perifera blod mononukleära celler (PBMC). Det finns dock flera begränsningar med sådana experiment. För det första kan dessa experiment inte lika lätt skalas som med NK92MI-celler. För det andra kan batch-to-batch-variation av cytoxisk aktivitet hos NK-celler som isolerats från PMBC vara problematisknär det gäller reproducerbarhet och tolkning av resultaten. På samma sätt beskrivs andra mänskliga NK-cellinjer i litteraturen och kan användas i dessa typer av experiment, inklusive NKL-celler29; Men till skillnad från NK-92MI celler, NKL celler är IL-2 beroende och inte kommersiellt tillgängliga.
När man överväger calcein AM experiment beskrivs, är det viktigt att notera att calcein AM kvar i apoptotiska organ efter celldöd30. Därför bör mängden kalcinerad avkalkning av kalcinerad AM utföras noggrant, eftersom det kan leda till en underskattning av NK cytotoxicitet.
I likhet med NK cellmedierad cytotoxicitet spelar modulering av NK-cellmigration genom cytokiner och andra kemoattractanter en viktig roll i regleringen av NK-cellfunktion. NK cell migration analys som beskrivs här ger en enkel plattform för att utvärdera NK cellmigration i samband med en stimulans såsom en chemokine eller chemoattractant. Denna analys kan användas för att utvärdera agenter som antingen kan främja eller störa NK cellmigration – vilket identifierar förstärkare och förtryckare av NK cellmigration. Denna metod kan också vara användbar för att studera NK-cellens regleringskapacitet till följd av en genetisk/epigenetisk förändring (uppreglering eller nedreglering) eller som uppstår på grund av läkemedelsbehandling.
För att exakt mäta NK-cellmigrering finns det få kritiska steg som bör följas. För alla experiment med konditionerat medium är det viktigt att likvärdigt konditionerat medium används från både kontroll- och behandlingsförhållanden för att få korrekta mätningar. Tiden för inkubation kommer att varieras med renade kemoattractanter och konditionerade medium. Slutligen är transwell migreringsanalyser väl etablerade och anses vara en utmärkt metod för att bedöma NK-cellmigrering. men de homogena monokulturer som används i analyserna saknar den komplexa fysiologi vävnader eller till och med 3D kulturer som mer exakt kan efterlikna tumör mikromiljön.
Även om det finns vissa begränsningar för nk-cellencytotoxicitetsanalyser och NK-migreringsanalys som presenteras i denna artikel, är dessa analyser således tillämpliga på ett brett spektrum av immunologiska studier och ger därmed viktiga och tillförlitliga metoder för att bedöma NK-cellen funktion och NK-cellmodulerande immunterapier.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner tacksamt bidrag från National Institutes of Health: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) och 1R01 CA218008-01A1 (NW). Vi erkänner också Försvarsdepartementet finansiering W81XWH1910480 och W81XWH-18-1-0069 till NW.
Absolute counting beads | Thermo Fisher Scientific | C36950 | |
Alpha-MEM | Sigma-Aldrich | M4256 | |
Amicon ultra Centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
Calcein AM dye | Sigma-Aldrich | 17783 | |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | |
Folic Acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
Horse Serum | Gibco | 16050114 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 2530081 | |
LDH cytotoxic assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
NK92MI cells | ATCC | CRL-2408 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
SKHEP-1 Cells | ATCC | HTB-52 | |
Transwell permeable chambers | Costar | 3241 | |
Trypsin EDTA solution | Gibco | 25200056 |