Unddragelse af naturlig dræber (NK) cellemedieret udryddelse af kræftceller er vigtig for kræft indledning og progression. Her præsenterer vi to ikke-radioaktivitetsbaserede protokoller for at evaluere NK cellemedieret cytotoksicitet mod levertumorceller. Derudover præsenteres en tredje protokol for at analysere NK-cellemigrering.
Naturlige killer (NK) celler er en delmængde af cytotoksisk lymfocyt population af medfødte immunsystem og deltage som en første linje i forsvaret ved at rydde patogen-inficerede, ondartede, og stressede celler. NK-cellernes evne til at udrydde kræftceller gør dem til et vigtigt redskab i kampen mod kræft. Flere nye immunbaserede behandlinger undersøges for kræftbehandling, som enten er afhængige af at forbedre NK-celleaktiviteten eller øge kræftcellernes følsomhed over for NK-cellemedieret udryddelse. Men for effektivt at udvikle disse terapeutiske tilgange, omkostningseffektive in vitro assays at overvåge NK cellemedieret cytotoksicitet og migration er også nødvendig. Her præsenterer vi to in vitro-protokoller, der pålideligt og reproducerbart kan overvåge effekten af NK-celle cytotoksicitet på kræftceller (eller andre målceller). Disse protokoller er ikke-radioaktivitetsbaserede, nemme at konfigurere og kan skaleres op til screening med høj gennemløb. Vi præsenterer også en flow cytometri-baseret protokol til kvantitativt overvåge NK celle migration, som også kan skaleres op til high-throughput screening. Samlet set kan disse tre protokoller bruges til at overvåge centrale aspekter af NK celle aktivitet, der er nødvendige for cellernes evne til at udrydde dysfunktionelle målceller.
Den menneskelige legemes evne til at identificere ikke-selv og udrydde fremmedlegemer er nøglen til menneskets overlevelse mod patogener og maligniteter1. Den menneskelige immunrespons spiller den vigtigste rolle i denne proces2,3,4. Baseret på centrale egenskaber og funktioner, kan det menneskelige immunsystem være bredt klassificeret i to store funktionelle grupper: adaptive immunsystem og medfødte immunsystem. Det adaptive immunsystem er typisk specifikt for et givet patogen og har immunologisk hukommelse og er derfor langvarig og lydhør over for fremtidig reinfektion med samme patogen5,6,7,8,9. Derimod er medfødt immunitet meget bredere i sin måludryddelse og relativt uspecifik. Derfor, typisk, den medfødte immunrespons fungerer som den første linje af immunologiske forsvar10. Naturlige dræberceller (NK) tilhører det medfødte immunsystem og udgør 10−15% af den samlede cirkulerende lymfocytter11. NK celler udrydde målceller via to store mekanismer. For det første, ved binding til målceller udtrykke aktivereligands, NK celler frigive membran-forstyrrende protein perforin og serin protease granzymes gennem exocytose, som i fællesskab fremkalde apoptose i målceller12,13,14,15. Derudover, NK celler udtrykker FasL og tumor nekrose faktor-relaterede apoptose-inducerende ligand (TRAIL) interagere med målceller udtrykke død receptorer (Fas/CD95), hvilket fører til caspase-afhængige apoptose16. Vigtigst er det, NK celler kræver ikke præstimulation, såsom antigen præsentation, at udrydde patogen-inficerede eller maligne celler; således er de normalt i en klar til at dræbe tilstand17,18. For at hæmme tumorudvikling og progression og udrydde kræftceller, NK celler skal migrere til tumor site og, en gang i tumor mikromiljøet, identificere og angribe målcellerne.
Tidligere blev NK-celleeffektorfunktioner primært overvåget ved degranulation og cytotoksicitetsanalyser19,20,21. NK celle cytotoksicitet kan også måles ved 51krom frigivelse assay22,23,24,25. Men denne analyse har nogle specifikke krav, herunder behovet for en gammatæller, og er radioaktivitet-baseret, hvilket kræver uddannelse i håndtering og bortskaffelse af radioaktive materialer og udgør en risiko for brugeren. Derfor er der udviklet og ansat flere nye ikke-radioaktivitetsbaserede analyser til at studere NK-celleaktivitet.
Her beskriver vi to sådanne protokoller, kolorimetrisk emælkesyredehydrogenase (LDH) målebaserede NK cellemedieret cytotoksicitetsanalyse og calcein acetoxymethyl (AM) farvningsbaseret mikroskopisk metode til måling af NK cellemedieret udryddelse af kræftceller. Disse analyser kræver ikke brug af radioisotoper, er ligetil, følsomme og reproducerbart identificere faktorer, der modulerer NK celle funktion. Da NK-cellefunktionen ikke kan evalueres fuldt ud uden at overvåge ændringer i NK-cellemigration, præsenterer vi også en flowcytometribaseret kvantitativ metode til overvågning af NK-cellemigration.
De cytotoksicitets- og migrationsmetoder, der er beskrevet her, kan bruges til at evaluere NK-cellecytotoksicitet for kræftceller og NK-cellemedierede immununddragelsesmekanismer i maligne tumorer samt til at identificere terapeutiske midler, der vil forbedre NK celleaktivitet/funktion. Protokollerne er enkle, følsomme, reproducerbare, og at foretrække alternativer til klassisk radioaktivitet-baserede 51chrom frigivelse assay. Protokollerne er specielt designet til at være let tilpasselige til brug i de fleste laboratorier, med enkle kolorimetriske, mikroskopiske, eller FACS-baserede udlæsninger, der er nemme at fortolke, så forskerne kan nå pålidelige konklusioner. Alle er skalerbare til screeningbaserede tilgange med høj gennemløb. Selv om protokollerne præsenteres i forbindelse med en enkelt levercellecellelinje, kan de nemt tilpasses let til andre kræftcelletyper og/eller andre ikke-kræftmålceller.
Mens alle de fremviste metoder er robuste og reproducerbare, kan der forekomme intereksperimentel variation med forskellige partier af kræftceller og NK-celler. For at sikre, at resultaterne nøjagtigt understøtter forsøgenes konklusioner, anbefales det at gentage forsøget mindst to gange ved hjælp af biologiske treeksemplarer.
En begrænsning af denne metode er, at vækstraten for NK92MI-celler kan være langsom. Derfor bør der for forsøg med 50 prøver eller flere prøver dyrkes et tilstrækkeligt antal NK92MI på forhånd for at undgå forsinkelser. Desuden skal alle de kontroller, der er beskrevet i protokollerne, gennemføres for at undgå falske og ikke-reproducerbare resultater. En anden begrænsning af NK cytotoksicitet assay er, at NK til kræft celle forholdet, samt inkubationstiden, skal optimeres for hver målcelle. For eksempel har vi testet forskellige forhold mellem kræftceller til NK celler (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, og 1:80) for hepatic cancer cellelinjer, samt flere inkubationstider (2, 3, 4, 5 og 6 timer). Baseret på vores resultater observerede vi de mest ensartede resultater med 1:10 og 1:20 forholdet mellem kræftceller og NK-celler og inkubation i 3 timer.
Desuden vil kræftceller stammer fra solide tumorer vedhæfte og vokse på overfladen af kulturpladen, mens NK celler vokser i suspension. Hvis inkubationstiden er længere end 3 timer, er det tilrådeligt at bruge ultralav fastgørelse 96 brøndplader, hvilket vil forbedre konsistensen og reproducerbarheden mellem eksperimenter og biologiske replikater. Det er også vigtigt at bemærke, at NK celle-induceret cytotoksicitet assays også kan udføres ved hjælp af primære NK celler isoleret fra perifere blod mononukleare celler (PBPC’er). Der er imidlertid flere begrænsninger med sådanne eksperimenter. For det første kan disse eksperimenter ikke skaleres så let som med NK92MI-celler. For det andet kan batch-to-batch variation af cytotoksisk aktivitet af NK-celler isoleret fra PMBC’er være problematisk med hensyn til reproducerbarhed og fortolkning af resultaterne. På samme måde er andre humane NK-cellelinjer beskrevet i litteraturen og kan anvendes i disse typer forsøg, herunder NKL-cellerne29; I modsætning til NK-92MI-celler er NKL-celler imidlertid IL-2 afhængige og ikke kommercielt tilgængelige.
Når man overvejer calcein AM eksperimenter beskrevet, er det vigtigt at bemærke, at calcein AM forbliver i apoptotiske organer efter celledød30. Derfor bør kvantitationen af calcein AM farvning udføres omhyggeligt, da det kan føre til en undervurdering af NK cytotoksicitet.
I lighed med NK cellemedieret cytotoksicitet spiller graduering af NK-cellemigration fra cytokiner og andre kemoattractanter en vigtig rolle i reguleringen af NK-cellefunktionen. NK celle migration analyse beskrevet her giver en enkel platform til at evaluere NK celle migration i forbindelse med en stimulus såsom en chemokine eller kemoattractant. Denne analyse kan bruges til at evaluere agenter, der enten kan fremme eller forstyrre NK celle migration – således at identificere smagsforstærkere og undertrykkere af NK celle migration. Denne metode kan også være nyttig til at undersøge NK-cellemigrationsreguleringskapaciteten som følge af genetiske/epigenetiske ændringer (upregulation eller downregulation) eller som følge af narkotikabehandling.
For præcist at måle NK celle migration, er der få kritiske skridt, der bør følges. For alle forsøg med konditioneret medium er det vigtigt, at tilsvarende konditioneret medium anvendes fra både kontrol- og behandlingsbetingelser for at opnå nøjagtige målinger. Inkubationstiden vil blive varieret med rensede kemoattractants og konditioneret medium. Endelig er transwell migration assays veletablerede og betragtes som en glimrende metode til at vurdere NK celle migration; men de homogene monokulturer, der anvendes i analyserne mangler den komplekse fysiologi af væv eller endda 3D-kulturer, der mere præcist kan efterligne tumor mikromiljøet.
Selv om der er visse begrænsninger for NK-cellecytotoksicitetsanalyserne og NK-migrationsanalysen, der præsenteres i denne artikel, gælder disse analyser således for en lang række immunologiske undersøgelser og giver dermed vigtige og pålidelige metoder til vurdering af NK-cellen funktion og NK celle modulerende immunterapi.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender taknemmeligt tilskud fra National Institutes of Health: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) og 1R01 CA218008-01A1 (NW). Vi anerkender også Department of Defense finansiering W81XWH1910480 og W81XWH-18-1-0069 til NW.
Absolute counting beads | Thermo Fisher Scientific | C36950 | |
Alpha-MEM | Sigma-Aldrich | M4256 | |
Amicon ultra Centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
Calcein AM dye | Sigma-Aldrich | 17783 | |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | |
Folic Acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
Horse Serum | Gibco | 16050114 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 2530081 | |
LDH cytotoxic assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
NK92MI cells | ATCC | CRL-2408 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
SKHEP-1 Cells | ATCC | HTB-52 | |
Transwell permeable chambers | Costar | 3241 | |
Trypsin EDTA solution | Gibco | 25200056 |