질 내 HIV 노출 및 HIV 감염 치료를 위한 인간화된 NOG 마우스
Summary
우리는 줄기 세포 이식, 질 내 인간 면역 결핍 바이러스 노출 및 액적 디지털 PCR RNA를 기반으로 인간화 및 인간 면역 결핍 바이러스 감염 NOG 마우스 모델의 생성 및 평가를위한 프로토콜을 개발했습니다. 정량화.
Abstract
인간화된 마우스는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 바이러스학을 공부하고 항 바이러스 약물을 테스트하는 정교한 플랫폼을 제공합니다. 이 프로토콜은 성인 NOG 마우스에서 인간 면역 계통의 확립을 기술한다. 여기에서, 우리는 탯줄 혈액 유래 인간 CD34+ 세포의 격리에서 마우스로의 그들의 후속 정맥 이식, HIV 감염을 통해 모델의 조작에, 조합 antiretroviral 치료의 모든 실용적인 단계를 설명합니다 ( cART) 및 혈액 샘플링. 대략 75,000 hCD34+ 세포는 마우스로 정맥 주사되고 인간화로 알려져 있는 인간적인 키메증의 수준, 말초 혈액에서 유동 세포측정에 의해 달 동안 세로로 추정됩니다. 총 75,000 hCD34+ 세포는 말초 혈액에서 20%-50% 인간 CD45+ 세포를 산출합니다. 마우스는 HIV를 가진 질 내 감염에 영향을 받기 쉽습니다 및 혈액은 분석을 위해 매주 한 번, 그리고 연장된 기간 동안 매달 두 번 샘플링될 수 있습니다. 이 프로토콜은 액적 디지털 PCR(ddPCR)을 사용하여 플라즈마 바이러스 부하의 정량화를 위한 분석서를 기술한다. 우리는 마우스가 규정식에 있는 배려의 표준 cART 식이요법으로 효과적으로 취급될 수 있는 방법을 보여줍니다. 일반 마우스 차우의 형태로 cART의 전달은 실험 모델의 중요한 정제이다. 이 모형은 새로운 처리 및 HIV 치료 전략의 시험을 위해 뿐만 아니라 전신 및 국소 전노출 예방 화합물의 전임상 분석을 위해 이용될 수 있습니다.
Introduction
인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)는 전 세계적으로 3,700 만 명 이상의 감염된 개인을 가진 만성감염입니다 1. 조합 항 바이러스 치료 (cART)는 생명을 구하는 치료이지만 치료법은 여전히 보증됩니다. 따라서, HIV에서 지속적인 연구를 촉진하기 위해 인간의 면역 체계와 그 반응을 반영하는 동물 모델에 대한 필요성이 있다. 세포 및 조직 생착을 지원할 수 있는 여러 종류의 인간화된 마우스는 인간 세포를 중증 면역결핍 마우스2로이식함으로써 개발되었다. 이러한 인간화 마우스는 HIV 감염에 취약하고 비인간 영장류보다 저렴하고 사용하기 쉽기 때문에 비인간 영장류 시미안 면역 결핍 바이러스 모델에 대한 중요한 대안을 제공합니다. 인간화 된 마우스는 HIV 바이러스 성 전염, 병인, 예방및 치료3,4,5,6,7,8,9,10, 11에서연구를 촉진했다.
우리는 NOD의 마우스로 코드 혈액 파생 인간 줄기 세포를 이식하여 개발 된 HIV 연구를위한 유연한 인간화 모델 시스템을 제시한다. Cg-Prkdc는Il2rgtm1Sug/ JicTac (NOG) 배경을scid. 비 태아 기원의 외, 이 마우스의 실제적인 생물 공학은 혈액 간 흉선 (BLT) 구조물의 이식에 관련시킨 마이크로 외과 적 절차에 비해 기술적으로 덜 까다롭습니다.
우리는 질 내 전송을 통해 HIV 감염을 확립하는 방법과 민감한 액적 디지털 PCR (ddPCR) 기반 설정으로 플라즈마 바이러스 부하를 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 그 후, 우리는 매일 마우스 다이어트의 일환으로 주어진 표준 cART의 설립을 설명합니다. 이러한 결합 된 방법의 목적은 동물에 대한 스트레스를 줄이고 각 동물을 처리하는 데 소요되는 시간이 제한되어 있는 대규모 실험을 용이하게하는것입니다 12.
인간에서는, CCR5Δ32/wt 또는 CCR5Δ32/Δ32 유전자형은 송신기/창시자 바이러스13를가진 HIV 감염에 감소된 감수성을 일으키는 원인이 되고, 몇몇 예방조치는 HIV 연구 결과의 목적을 위해 줄기 세포를 가진 생명 공학 인간화한 마우스를 취할 필요가 있습니다. 이것은 CCR5 유전자, 특히 Δ32 삭제에서 자연적으로 발생하는 변이체가 스칸디나비아 및 발트 원주민 인구에서 세계14,15의나머지 부분에 비해 더 널리 퍼져 있기 때문에 우리 지역에서 특히 그렇습니다. 따라서, 당사의 프로토콜은 이식 전에 CCR5 변이체에 대한 공여자 조혈 줄기 세포를 스크리닝하기 위한 쉬운, 높은 처리량 분석방법을 포함한다.
질 내 노출을 위해 우리는 감염의 초기 단계에서 여자에게서 격리된 송신기/창시자 R5 바이러스 RHPA4259를 선택했습니다16. 우리는 마우스의 대다수에 있는 성공적인 전송을 산출하기 위하여 충분한 바이러스성 복용량에 마우스를 노출했습니다, 그러나 100% 전송 비율 의 밑에. 이러한 투여량을 선택하면 약물 후보의 항 바이러스 효과가 HIV 예방 실험에서 보호 된 동물을 초래할 수 있고 치료 연구를위한 바이러스 부하가 감소 할 수 있도록 전송 속도에서 충분한 동적 범위를 가능하게합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
가혹하게 면역 손상된 마우스 변형 NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac(NOG)는 인간 세포 및 조직의 이식에 매우 적합합니다. 이 마우스에 있는 선천적이고 적응적인 면역 통로 둘 다 손상됩니다. NOG 및 NSG 마우스는 결함이 있는 T 및 B 세포 기능을 초래하는 Prkdcscid 돌연변이를 품고 있습니다. 더욱이, 이들 마우스는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21과 같은 많?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 오르후스 대학의 생물 의학 동물 시설 직원, 특히 식민지 유지 보수 노력과 마우스 무게를 추적하기위한 Jani Kær 씨에게 감사드립니다. 저자는 표준 치료 cART를 개발하고 지도에 대한 플로리안 클라인 교수에게 감사드립니다. 다음 시약은 NIH 에이즈 시약 프로그램, 에이즈 학과, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (고양이# 11744) 존 카페스 박사와 크리스티나 오크센바우어 박사를 통해 얻어졌습니다.
Materials
| Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
| CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
| CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
| CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
| CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
| DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
| DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
| dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
| Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
| FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
| Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
| Heating lamp | Custom made | ||
| Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
| Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
| Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
| Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
| Mouse restrainer | Custom made product | ||
| Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
| Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
| PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
| Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
| Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
| Proteinase K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
| QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
| RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
| RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
| Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
| Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
| Trypane blue | Sigma | T8154 | |
| Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |
References
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