أنسوية NOG الفئران للتعرض لفيروس نقص المناعة البشرية داخل المهبل وعلاج عدوى فيروس نقص المناعة البشرية
Summary
لقد وضعنا بروتوكولا لتوليد وتقييم نموذج الماوس NOG المصاب بفيروس نقص المناعة البشرية الإنسان على أساس زرع الخلايا الجذعية، والتعرض لفيروس نقص المناعة البشرية داخل المهبل، وقطرات PCR RNA الرقمية التحديد الكمي.
Abstract
توفر الفئران الأنسّمة منصة متطورة لدراسة فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) ولاختبار الأدوية المضادة للفيروسات. يصف هذا البروتوكول إنشاء جهاز مناعة بشري في فئران NOG البالغة. هنا ، نشرح جميع الخطوات العملية من عزل دم الحبل السري المستمدة من خلايا CD34 البشرية وزرعها عن طريق الوريد في الفئران ، إلى التلاعب في النموذج من خلال عدوى فيروس نقص المناعة البشرية ، والجمع بين العلاج المضاد للفيروسات القهقرية ( cART)، وأخذ عينات الدم. يتم حقن ما يقرب من 75000 hCD34 + الخلايا عن طريق الوريد في الفئران ومستوى التشيميرة البشرية ، والمعروفة أيضا باسم أنسنة ، في الدم المحيطي ويقدر طوليا لعدة أشهر عن طريق قياس التدفق الخلوي. ما مجموعه 75،000 hCD34 + الخلايا تسفر عن 20٪ -50٪ خلايا CD45+ الإنسان في الدم المحيطي. الفئران عرضة للعدوى داخل المهبل بفيروس نقص المناعة البشرية والدم يمكن أن تؤخذ عينات مرة واحدة أسبوعيا للتحليل، ومرتين شهريا لفترات طويلة. يصف هذا البروتوكول كمية كمية من الحمل الفيروسي البلازما باستخدام قطرة PCR الرقمية (ddPCR). نحن نظهر كيف يمكن التعامل مع الفئران بشكل فعال مع نظام cART القياسية للرعاية في النظام الغذائي. تسليم cART في شكل تشاو الماوس العادية هو صقل كبير للنموذج التجريبي. ويمكن استخدام هذا النموذج للتحليل قبل السريري لكل من مركبات الوقاية قبل التعرض الجهازية والموضعية وكذلك لاختبار العلاجات الجديدة واستراتيجيات علاج فيروس نقص المناعة البشرية.
Introduction
فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) هو عدوى مزمنة مع أكثر من 37 مليون شخص مصاب في جميع أنحاء العالم1. مزيج العلاج المضاد للفيروسات (cART) هو العلاج المنقذ للحياة، ولكن لا يزال هناك ما يبرر العلاج. وبالتالي، هناك حاجة إلى نماذج الحيوانات التي تعكس جهاز المناعة البشري واستجاباته من أجل تسهيل البحوث المستمرة في مجال فيروس نقص المناعة البشرية. وقد وضعت أنواع متعددة من الفئران أنسنة قادرة على دعم الخلايا والأنسجة الترقيع عن طريق زرع الخلايا البشرية في الفئران نقص المناعة الشديد2. وهذه الفئران الأنمنية معرضة للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية وتوفر بديلا هاما لنماذج فيروس نقص المناعة سيميان الرئيسيات غير البشرية، لأنها أرخص وأبسط في الاستخدام من الرئيسيات غير البشرية. وقد سهلت الفئران أنسنة البحوث في انتقال فيروس نقص المناعة البشرية الفيروسية، الإمراض، والوقاية، والعلاج3،4،5،6،7،8،9،10،11.
نحن نقدم نظام نموذج إنساني مرن لأبحاث فيروس نقص المناعة البشرية التي تم تطويرها عن طريق زرع الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من دم الحبل السري في فئران NOD. Cg-كورياالديمقراطيةscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) الخلفية. إلى جانب كونها من أصل غير الجنيني ، فإن الهندسة الحيوية العملية لهذه الفئران أقل تطلبًا من الناحية الفنية مقارنة بالعمليات الجراحية الدقيقة المشاركة في زراعة بناء الغدة الصعترية للدم الكبد (BLT).
نعرض كيفية تحديد عدوى فيروس نقص المناعة البشرية من خلال انتقال العدوى داخل المهبل وكيفية مراقبة الحمل الفيروسي البلازما مع القطرة الحساسة الرقمية PCR (ddPCR) القائم على الإعداد. في وقت لاحق، ونحن نصف إنشاء cART القياسية نظرا كجزء من النظام الغذائي الماوس اليومي. والهدف من هذه الأساليب مجتمعة هو الحد من الإجهاد على الحيوانات وتسهيل التجارب على نطاق واسع حيث الوقت الذي يقضيه في التعامل مع كل الحيوانات محدودة12.
في البشر، وCCR5Ο32/wt أو CCR5Ο32/ Ο32 يؤدي إلى انخفاض التعرض للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية مع الفيروسات المرسل / مؤسس13،ويجب اتخاذ بعض الاحتياطات عند الهندسة الحيوية أنسنة الفئران مع الخلايا الجذعية لغرض دراسات فيروس نقص المناعة البشرية. هذا صحيح بشكل خاص في منطقتنا لأن المتغيرات التي تحدث بشكل طبيعي في الجين CCR5 ، وخاصة عمليات الحذف 32 ، هي أكثر انتشارا في السكان الأصليين الاسكندنافية والبلطيق مقارنة ببقية العالم14،15. وهكذا، يتضمن بروتوكولنا فحصسهل وعالي الإنتاجية لفحص الخلايا الجذعية الهيماتوبوية المانحة للمتغيرات CCR5 قبل الزرع.
للتعرض داخل المهبل اخترنا الارسال / مؤسس R5 فيروس RHPA4259، معزولة عن امرأة في مرحلة مبكرة من العدوى الذين أصيبوا عن طريق المهبل16. لقد عرّضنا الفئران لجرعة فيروسية كانت كافية لإنتاج انتقال ناجح في غالبية الفئران، ولكن أقل من معدل انتقال 100%.. ويتيح اختيار هذه الجرعة نطاقا ً دينامياً كافياً في معدل انتقال العدوى بحيث يمكن أن تؤدي الآثار المضادة للفيروسات لمرشح المخدرات إلى حماية الحيوانات في تجارب الوقاية من فيروس نقص المناعة البشرية وانخفاض الحمل الفيروسي لدراسات العلاج.
Protocol
Representative Results
Discussion
سلالة الفأر المنقوصة بشدة NOD. Cg-كوريادscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) هو مناسب للغاية لزرع الخلايا والأنسجة البشرية. يتم اختراق كل من المسارات المناعية الفطرية والتكيفية في هذه الفئران. NOG والفئران NSG تؤوي طفرةمبيد ة Prkdc التي تؤدي إلى وظيفة خلية T و B معيبة. وعلاوة على ذل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا موظفي مرفق الطب الحيوي للحيوانات في جامعة آرهوس، ولا سيما السيدة جاني كور على جهود صيانة المستعمرات وتتبع أوزان الفئران. ويود المؤلفون أن يشكروا البروفيسور فلوريان كلاين على تطويره معيار الرعاية وللتوجيه. تم الحصول على الكاشف التالي من خلال برنامج كاشف الإيدز في المعاهد القومية للصحة، شعبة الإيدز، NIAID، المعاهد القومية للصحة: pRHPA.c/2635 (القط رقم 11744) من الدكتور جون كاباس والدكتورة كريستينا أوكسنباور.
Materials
| Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
| CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
| CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
| CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
| CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
| DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
| DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
| dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
| Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
| FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
| Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
| Heating lamp | Custom made | ||
| Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
| Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
| Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
| Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
| Mouse restrainer | Custom made product | ||
| Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
| Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
| PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
| Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
| Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
| Proteinase K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
| QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
| RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
| RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
| Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
| Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
| Trypane blue | Sigma | T8154 | |
| Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |
References
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
- Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829 (2010).
- Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44 (2012).
- Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
- Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
- Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209 (2011).
- Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257 (2010).
- Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
- Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169 (2011).
- Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
- Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
- Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
- Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
- Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
- Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
- Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
- Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
- Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
- Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
- Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
- Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
- Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
- Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. DPCR: A technology review. Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).
- Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
- Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
- Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
- Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
- Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).
