JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생화학

Berigelse af pattedyrvæv og Xenopus Oocytter med kolesterol

Published: March 25, 2020
doi:
10.3791/60734
, , , , ,
1Department of Pharmacology, Addiction Science and Toxicology,The University of Tennessee HSC, 2Department of Chemistry,University of Illinois at Chicago

Summary

To metoder til kolesterol berigelse præsenteres: anvendelse af cyclodextrin mættet med kolesterol til at berige pattedyr væv og celler, og brugen af kolesterol-beriget fosfolipid-baserede dispersioner (liposomer) til at berige Xenopus oocytter. Disse metoder er medvirkende til at bestemme virkningen af forhøjede kolesterolniveauer i molekylære, cellulære, og organfunktion.

Abstract

Kolesterol berigelse af pattedyr væv og celler, herunder Xenopus oocytter anvendes til at studere cellefunktion, kan opnås ved hjælp af en række forskellige metoder. Her beskriver vi to vigtige tilgange, der anvendes til dette formål. Først beskriver vi, hvordan man beriger væv og celler med kolesterol ved hjælp af cyclodextrin mættet med kolesterol ved hjælp af cerebrale arterier (væv) og hippocampale neuroner (celler) som eksempler. Denne fremgangsmåde kan bruges til enhver type væv, celler eller cellelinjer. En alternativ tilgang til kolesterol berigelse indebærer brug af low-density lipoprotein (LDL). Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at det bruger en del af den naturlige kolesterol homøostase maskiner i cellen. Mens cyclodextrin-metoden kan anvendes til at berige enhver celletype af interesse med kolesterol, er LDL-metoden dog begrænset til celler, der udtrykker LDL-receptorer (f.eks. leverceller, knoglemarvsafledte celler såsom blodleukocytter og vævsmakrofager), og graden af berigelse afhænger af koncentrationen og mobiliteten af LDL-receptoren. Endvidere, LDL partikler omfatter andre lipider, så kolesterol levering er uspecifik. For det andet, Vi beskriver, hvordan man berigeR Xenopus oocytter med kolesterol ved hjælp af en fosfolipid-baseret dispersion (dvs. liposomer), der omfatter kolesterol. Xenopus oocytter udgør et populært heterologt udtrykssystem, der anvendes til at studere celle- og proteinfunktion. For både cyclodextrin-baserede kolesterol berigelse tilgang pattedyr væv (cerebral arterier) og for fosfolipid-baserede kolesterol berigelse tilgang af Xenopus oocytter, viser vi, at kolesterolniveauer nå et maksimum efter 5 min inkubation. Dette niveau af kolesterol forbliver konstant i længere perioder med inkubation (f.eks. 60 min). Tilsammen danner disse data grundlag for optimerede tidsmæssige betingelser for kolesterolberigelse af væv, celler og Xenopus oocytter til funktionelle undersøgelser, der har til formål at afhøre virkningen af kolesterolberigelse.

Introduction

Kolesterol, en stor cellulære lipid, spiller mange kritiske funktionelle og strukturelle roller1,2,,3,,4,,5,,6,,7,8,9. Fra regulering af plasmamembranens fysiske egenskaber til sikring af cellernes levedygtighed, vækst, spredning og tjener som et signal- og forløbermolekyle i et væld af biokemiske veje, er kolesterol en nødvendig komponent, der er nødvendig for normal celle- og organfunktion. Som et resultat, kolesterolmangel resulterer i alvorlige fysiske misdannelser og en række lidelser. På den anden side, selv en lille stigning i kolesterol over fysiologiske niveauer (2-3x) er cytotoksisk1,,2,,10 og har været forbundet med udviklingen af lidelser, herunder hjerte-kar-1111,12,13 og neurodegenerative sygdomme14,15,16,17. Således, at afhøre de kritiske funktioner af kolesterol og til at bestemme effekten af ændringer i kolesterolniveauer, forskellige tilgange, der ændrer indholdet af kolesterol i væv, celler, og Xenopus oocytter er blevet udviklet.

Ændring af kolesterolniveauer i pattedyrvæv og -celler
Flere tilgange kan udnyttes til at nedsætte niveauet af kolesterol i væv og celler18. En tilgang indebærer deres eksponering for statiner opløst i lipoprotein-mangelfuld serum til at hæmme HMG-CoA reduktase, som styrer antallet af kolesterol syntese19,20. Men, disse kolesterolsænkende lægemidler hæmmer også dannelsen af ikke-sterol produkter langs mevalonat e pathway. Derfor tilsættes en lille mængde mevalonat for at gøre det muligt at danne disse produkter21 og forbedre specificiteten af denne fremgangsmåde. En anden tilgang til faldende kolesterolniveauer indebærer brug af β-cyclodextrins. Disse glucopyranose monomerer besidder en intern hydrofob hulrum med en diameter, der matcher størrelsen af steroler22, som letter udvinding af kolesterol fra celler, og dermed nedbryder dem fra deres oprindelige kolesterolindhold23. Et eksempel er 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD), et præklinisk lægemiddel, der i øjeblikket testes til behandling af Niemann-Pick type C-sygdommen, en genetisk arvelig dødelig metabolisk lidelse karakteriseret ved lysosomal kolesterolopbevaring24. Niveauet af kolesterol udtynding afhænger af den specifikke afledte anvendes. 25,26,27,28,29HPβCD udtrækker24,f.eks.,30 Især, dog, β-cyclodextrins kan også udtrække andre hydrofobe molekyler ud over kolesterol, som derefter kan resultere i uspecifikke virkninger31. I modsætning til udtynding, celler og væv kan specifikt beriget med kolesterol gennem behandling med β-cyclodextrin, der er blevet præmættet med kolesterol23. Denne fremgangsmåde kan også anvendes som en kontrol for specificiteten af β-cyclodextrin, der anvendes til kolesterol udtynding31. Udtømning af kolesterol fra væv og celler er ligetil og kan opnås ved at udsætte cellerne i 30-60 min til 5 mM MβCD opløst i det medium, der anvendes til opbevaring af cellerne. Denne fremgangsmåde kan resultere i en 50% fald i kolesterolindholdet (f.eks i hippocampal neuroner32, rotte cerebral arterier33). På den anden side, forberedelse af β-cyclodextrin-kolesterol kompleks for kolesterol berigelse af væv og celler er mere kompleks, og vil blive beskrevet i protokollen afsnit.

En alternativ tilgang til berigelse af væv og celler ved hjælp af β-cyclodextrin mættet med kolesterol indebærer brug af LDL, som er afhængig af LDL-receptorer udtrykt i væv / celler18. Mens denne tilgang giver den fordel, at bruge den naturlige kolesterol homøostase maskiner i cellen, det har flere begrænsninger. For det første kan væv og celler, der ikke udtrykker LDL-receptoren, ikke beriges ved hjælp af denne fremgangsmåde. For det andet, LDL partikler indeholder andre lipider ud over kolesterol. Ldl består specifikt af proteinet ApoB100 (25%) og følgende lipider (75%): ~ 6-8% kolesterol, ~ 45-50% cholesteryl ester, ~ 18-24% fosfolipider, og ~ 4-8% triacylglyceroler34. Således levering af kolesterol via LDL partikler er uspecifik. For det tredje, den procentdel af stigningen i kolesterol indhold af LDL i væv og celler, der udtrykker LDL receptor kan være betydeligt lavere end stigningen observeret ved hjælp af cyclodextrin mættet med kolesterol. For eksempel, i en tidligere undersøgelse, berigelse af gnaver cerebral arterier med kolesterol via LDL resulterede i kun en 10-15% stigning i kolesterolniveauer35. I modsætning hertil resulterede berigelse af disse arterier med cyclodextrin mættet med kolesterol som beskrevet i protokolafsnittet i >50% stigning i kolesterolindholdet (se afsnittet Repræsentative resultater, figur 1).

Ændring af kolesterolniveauer i Xenopus oocytter
Xenopus oocytter udgør et heterologt ekspressionssystem, der almindeligvis anvendes til at studere celle- og proteinfunktion. Tidligere undersøgelser har vist, at kolesterol til fosfolipid molære forholdet i Xenopus oocytter er 0,5 ± 0,136. På grund af denne iboende højt niveau af kolesterol, øge indholdet af kolesterol i dette system er udfordrende, men kan opnås ved hjælp af dispersioner fremstillet af membran fosfolipider og kolesterol. De fosfolipider, som vi har valgt til dette formål, svarer til dem, der anvendes til dannelse af kunstige planar lipid bilag og omfatter L-α-phosphatidylethanolamin (POPE) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serin (POPS), som beskrevet i afsnittet protokol. Denne fremgangsmåde kan resultere i >50% stigning i kolesterolindholdet (se afsnittet Repræsentative resultater, figur 2).

En alternativ tilgang til berigelse af Xenopus oocytter med fosfolipid-baserede dispersioner indebærer brug af cyclodextrin mættet med kolesterol, hvilket svarer til den måde væv og celler er beriget. Men vi har fundet denne tilgang til at være af lav reproducerbarhed og effektivitet, med et gennemsnit på ~ 25% stigning i kolesterolindholdet. Dette skyldes muligvis disse to tilganges forskellige lasteevne (se afsnittet repræsentative resultater, figur 3). I modsætning hertil har det vist sig, at ved hjælp af cyclodextrin at nedbryder kolesterol fra Xenopus oocytter kan resultere i en ~ 40% fald i kolesterolindhold36.

Her fokuserer vi på kolesterol berigelse af pattedyr væv og celler gennem anvendelse af cyclodextrin mættet med kolesterol, og af Xenopus oocytter ved hjælp af liposomer. Begge tilgange kan udnyttes til at afgrænse effekten af forhøjede niveauer af kolesterol på protein funktion. Mekanismerne for kolesterolmodulering af proteinfunktion kan omfatte direkte interaktioner8 og/eller indirekte virkninger9. Når kolesterol påvirker protein funktion via direkte interaktioner, effekten af en stigning i kolesterolniveauer på protein aktivitet er sandsynligvis uafhængig af celletype, ekspressionssystem, eller berigelse tilgang. For eksempel, Vi udnyttede disse to tilgange til at bestemme effekten af kolesterol på G-protein gated indadrettekalium (GIRK) kanaler udtrykt i atriemyocytter37, hippocampal neuroner32,38, HEK29339 celler, og Xenopus oocytter32,37. Resultaterne af disse undersøgelser var konsistente: i alle tre typer pattedyrceller og i padderoocytter kolesterol upregulated GIRK kanalfunktion (se repræsentant resultater afsnit, Figur 4, for hippocampal neuroner og de tilsvarende eksperimenter i Xenopus oocytter). Endvidere, observationerne i disse undersøgelser var også i overensstemmelse med resultaterne af undersøgelser udført i atriemyocytter37,40 og hippocampal neuroner32,38 frisk isoleret fra dyr udsat for en høj kolesterol kost40. Især kolesterol berigelse af hippocampal neuroner ved hjælp af MβCD vendt effekten af atorvastatin terapi anvendes til at løse virkningen af højt kolesteroltal kost både på kolesteroltallet og GIRK funktion38. I andre undersøgelser undersøgte vi effekten af mutationer på kolesterolfølsomheden af den indadvendte korrigere kaliumkanal Kir2.1 ved hjælp af både Xenopus oocytter og HEK293 celler41. Igen var mutationernes virkning på kanalens følsomhed ens i de to systemer.

Anvendelserne af begge berigelse metoder til bestemmelse af virkningen af forhøjede kolesterolniveauer på molekylære, cellulære, og organfunktion er talrige. Især er brugen af cyclodextrin-kolesterol komplekser til at berige celler og væv meget almindeligt i vid udstrækning på grund af dens specificitet. Nylige eksempler på denne tilgang omfatter bestemmelse af virkningen af kolesterol på HERG kanal aktivering og underliggende mekanismer42, opdagelsen af, at kolesterol aktiverer G-protein koblet receptor glattet til at fremme Pindsvin signalering43, og identifikation af den rolle, kolesterol i stamceller biomekanik og adipogenesis gennem membran-associerede linker proteiner44. I vores eget arbejde, vi udnyttede pattedyr væv berigelse med MβCD: kolesterol kompleks til at studere effekten af kolesterol berigelse på grundlæggende funktion og farmakologisk profil af calcium- og spænding-gated kanaler af stor ledningsevne (BK, MaxiK) i vaskulære glatte muskel35,45,46. I andre undersøgelser, Vi brugte fosfolipid-baserede dispersion tilgang til at berige Xenopus oocytter med kolesterol til at bestemme rollerne af forskellige regioner i Kir2.1 og GIRK kanaler i kolesterol følsomhed41,47,48,49, samt at bestemme formodede kolesterol bindende steder i disse kanaler32,50,51.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer med dyr blev udført på University of Tennessee Health Science Center (UTHSC). Pasning af dyr og forsøgsprotokoller blev gennemgået og godkendt af Animal Care and Use Committee of the UTHSC, som er en institution, der er akkrediteret af Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International. 1. Berigelse af væv og celler ved hjælp af methyl-β-cyclodextrin mættet med kolesterol BEMÆRK: Nedenstående …

Representative Results

Brugen af cyclodextrin mættet med kolesterol som et middel til at berige væv og celler med kolesterol er veletableret. Her viser vi først anvendelsen af denne udbredte tilgang til berigelse af rottecerebrale arterier med kolesterol ved hjælp af MβCD mættet med kolesterol. Figur 1A viser et eksempel på et afbildet cerebralarterieglat muskellag og viser den koncentrationsafhængige stigning i filippineret fluorescens opnået ved vævsber…

Discussion

Metoder til berigelse af pattedyrvæv og -celler og Xenopus oocytter med kolesterol udgør et effektivt redskab til at undersøge virkningen af forhøjede kolesterolniveauer på individuelle molekylære arter, på komplekse makromolekylære systemer (f.eks. proteiner) og på celle- og organfunktion. I dette dokument har vi beskrevet to komplementære tilgange, der letter sådanne undersøgelser. Først beskrev vi, hvordan man beriger væv og celler med kolesterol ved hjælp af MβCD mættet med kolesterol. Vi vi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af en Scientist Development Grant (11SDG5190025) fra American Heart Association (til A.R.-D.), og af National Institute of Health R01 tilskud AA-023764 (til A.N.B.), og HL-104631 og R37 AA-11560 (til A.M.D).

Materials

Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
  2. Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
  3. Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. 생화학. 36, 10959-10974 (1997).
  4. Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
  5. Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
  6. Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
  7. Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
  8. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. , 1135 (2019).
  9. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. , 1115 (2019).
  10. Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
  11. Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
  12. Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
  13. Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
  14. Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration?. Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
  15. Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer’s disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
  16. Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage?. Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
  17. Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
  18. Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
  19. Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
  20. Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
  21. Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
  22. López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020 (2011).
  23. Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
  24. Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
  25. Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054 (2010).
  26. Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
  27. Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
  28. Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
  29. Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
  30. Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
  31. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
  32. Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
  33. Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
  34. Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
  35. Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
  36. Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
  37. Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
  38. Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
  39. Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
  40. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A., Kumar, S. A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. , 95-119 (2015).
  41. Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
  42. Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
  43. Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304 (2016).
  44. Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. , (2019).
  45. North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
  46. Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
  47. Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
  48. Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
  49. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
  50. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
  51. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
  52. Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
  53. Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
  54. Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).

Tags

Cholesterol EnrichmentXenopus OocytesHypercholesterolemiaCellular MembranesCerebral ArteriesCircle Of WillisMethyl-beta-cyclodextrinCholesterol Saturated SolutionLipid HandlingFilipin Staining
check_url/kr/60734?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image