Arricchimento dei tessuti mammiferi e Xenopus Oocytes con colesterolo
Summary
Sono presentati due metodi di arricchimento del colesterolo: l’applicazione di ciclodextrin satura di colesterolo per arricchire tessuti e cellule mammiferi e l’uso di dispersioni a base di fosfolipidi arricchiti di colesterolo (liposomi) per arricchire gli evociti di Xenopo. Questi metodi sono fondamentali per determinare l’impatto dei livelli elevati di colesterolo nella funzione molecolare, cellulare e dell’organo.
Abstract
L’arricchimento del colesterolo dei tessuti e delle cellule dei mammiferi, compresi gli evociti di Xenopus utilizzati per studiare la funzione cellulare, può essere realizzato utilizzando una varietà di metodi. In questo caso, descriviamo due approcci importanti utilizzati a questo scopo. In primo luogo, descriviamo come arricchire tessuti e cellule con colesterolo usando ciclodextrin saturi di colesterolo usando arterie cerebrali (tessuti) e neuroni ippocampali (cellule) come esempi. Questo approccio può essere utilizzato per qualsiasi tipo di tessuto, cellule o linee cellulari. Un approccio alternativo per l’arricchimento del colesterolo prevede l’uso di lipoproteina a bassa densità (LDL). Il vantaggio di questo approccio è che utilizza parte della macchina naturale dell’omeostasi del colesterolo della cellula. Tuttavia, mentre l’approccio ciclodextrin può essere applicato per arricchire qualsiasi tipo di interesse cellulare con il colesterolo, l’approccio LDL è limitato alle cellule che esprimono i recettori LDL (ad esempio, le cellule epatiche, le cellule derivate dal midollo osseo come i leucociti e i macrofagi tissutali), e il livello di arricchimento dipende dalla concentrazione e dalla mobilità del recettore LDL. Inoltre, le particelle Di LDL includono altri lipidi, quindi la somministrazione di colesterolo non è specifica. In secondo luogo, descriviamo come arricchire gli ovociti di Xenopus con colesterolo usando una dispersione a base di fosforidi (cioè liposomi) che include il colesterolo. Gli ovociti Xenopus costituiscono un popolare sistema di espressione eterologa utilizzato per studiare la funzione cellulare e proteica. Sia per l’approccio di arricchimento del colesterolo basato su ciclodintrina del tessuto dei mammiferi Xenopus (arterie cerebrali) sia per l’approccio di arricchimento del colesterolo basato su fosfori di nociti, dimostriamo che i livelli di colesterolo raggiungono un massimo dopo 5 min di incubazione. Questo livello di colesterolo rimane costante durante lunghi periodi di incubazione (ad esempio, 60 min). Insieme, questi dati forniscono la base per condizioni temporali ottimizzate per l’arricchimento del colesterolo di tessuti, cellule e evociti di Xenopus per studi funzionali volti a interrogare l’impatto dell’arricchimento del colesterolo.
Introduction
Il colesterolo, un grande lipido cellulare, svolge numerosi ruoli funzionali e strutturali critici1,2,3,4,5,6,7,8,9. Dalla regolazione delle proprietà fisiche della membrana plasmatica a garantire la vitalità cellulare, la crescita, la proliferazione e fungere da segnalazione e molecola precursore in una pletora di vie biochimiche, il colesterolo è un componente imperativo necessario per la normale funzione cellulare e dell’organo. Di conseguenza, la carenza di colesterolo si traduce in gravi malformazioni fisiche e una varietà di disturbi. D’altra parte, anche un piccolo aumento del colesterolo al di sopra dei livelli fisiologici (2-3x) è citotossico1,2,10 ed è stato associato allo sviluppo di disturbi, tra cui cardiovascolare11,12,13 e malattie neurodegenerative14,15,16,17. Così, per interrogare le funzioni critiche del colesterolo e per determinare l’effetto dei cambiamenti nei livelli di colesterolo, sono stati sviluppati diversi approcci che alterano il contenuto di colesterolo nei tessuti, nelle cellule e negli ovociti di Xenopus.
Alterazione dei livelli di colesterolo nei tessuti e nelle cellule dei mammiferi
Diversi approcci possono essere sfruttati per diminuire i livelli di colesterolo nei tessuti e nelle cellule18. Un approccio prevede la loro esposizione alle statine disciolte nel siero carente di lipoproteina per inibire la reductasi HMG-CoA, che controlla il tasso di sintesi del colesterolo19,20. Tuttavia, questi farmaci per abbassare il colesterolo inibiscono anche la formazione di prodotti non sterolo lungo il percorso mevalonato. Pertanto, viene aggiunta una piccola quantità di mevalonato per consentire la formazione di questi prodotti21 e migliorare la specificità di questo approccio. Un altro approccio per diminuire i livelli di colesterolo coinvolge l’uso di z-ciclodextrins. Questi monomeri glucopyranosi possiedono una cavità idrofobica interna con un diametro che corrisponde alla dimensione di steroli22, che facilita l’estrazione del colesterolo dalle cellule, esaurendoli così dal loro contenuto nativo di colesterolo23. Un esempio è costituito da 2-idrossipropyl-z-ciclodextrin (HP-cyclodextrin, un farmaco preclinico attualmente in fase di test per il trattamento della malattia di Niemann-Pick di tipo C, una malattia metabolica fatale ereditata geneticamente ereditata caratterizzata dall’accumulo di colesterolo lisonio24. Il livello di esaurimento del colesterolo dipende dal derivato specifico utilizzato. Ad esempio, l’HP-CD estrae il colesterolo con una capacità inferiore rispetto al derivato metilato, metil-z-ciclodextrin (M-CD)24,25,26,27,28,29,30. In particolare, tuttavia, il ciclodextrintrins può anche estrarre altre molecole idrofobiche oltre al colesterolo, il che può poi provocare effetti non specifici31. A differenza dell’esaurimento, le cellule e i tessuti possono essere specificamente arricchiti con colesterolo attraverso il trattamento con ciclodextrina che è stato presaturato con colesterolo23. Questo approccio può essere utilizzato anche come controllo per la specificità di z-ciclodextrins utilizzato per l’esaurimento del colesterolo31. L’esaurimento del colesterolo dai tessuti e dalle cellule è semplice e può essere raggiunto esponendo le cellule per 30-60 min a 5 mM-MCD disciolti nel mezzo utilizzato per la conservazione delle cellule. Questo approccio può provocare una diminuzione del 50% del contenuto di colesterolo (ad esempio, nei neuroni ippocampali32, arterie cerebrali del ratto33). D’altra parte, preparare il complesso di colesterolo z-cyclodextrin-colesterolo per l’arricchimento del colesterolo dei tessuti e delle cellule è più complesso, e sarà descritto nella sezione protocollo.
Un approccio alternativo all’arricchimento dei tessuti e delle cellule che utilizzano la saturazione di colesterolo derivante dal colesterolo, che si basa sui recettori LDL espressi nei tessuti/cellule18. Mentre questo approccio offre il vantaggio di utilizzare il meccanismo naturale di omeostasi colesterolo della cellula, ha diverse limitazioni. In primo luogo, i tessuti e le cellule che non esprimono il recettore LDL non possono essere arricchiti con questo approccio. In secondo luogo, le particelle LDL contengono altri lipidi oltre al colesterolo. In particolare, LDL è costituito dalla proteina ApoB100 (25%) e i seguenti lipidi (75%): colesterolo del 6-8%, 45-50% di esteri di colesterile, 18-24% fosforidi, e 34 triacylgliceroli34. Pertanto, la somministrazione di colesterolo tramite particelle LDL non è specifica. In terzo luogo, la percentuale di aumento del contenuto di colesterolo da LDL nei tessuti e nelle cellule che esprimono il recettore LDL può essere significativamente inferiore all’aumento osservato utilizzando ciclodextrin saturo di colesterolo. Ad esempio, in uno studio precedente, l’arricchimento delle arterie cerebrali dei roditori con colesterolo tramite LDL ha provocato solo un aumento del 10-15% nei livelli di colesterolo35. Al contrario, l’arricchimento di queste arterie con ciclodextrin saturo di colesterolo come descritto nella sezione protocollo ha provocato >50% aumento del contenuto di colesterolo (Vedi sezione Risultati rappresentativi, Figura 1).
Alterazione dei livelli di colesterolo in Xenopus oecytes
Gli ovociti Xenopus costituiscono un sistema di espressione eterologa comunemente usato per studiare la funzione cellulare e proteica. Studi precedenti hanno dimostrato che il rapporto di colesterolo al molare fosfolipide in Xenopus oocytes è 0,5 x 0,136. A causa di questo alto livello intrinseco di colesterolo, aumentare il contenuto di colesterolo in questo sistema è impegnativo, ma può essere raggiunto utilizzando dispersioni a base di fosfolipidi di membrana e colesterolo. I fosfolipidi che abbiamo scelto per questo scopo sono simili a quelli utilizzati per formare bistrato ibici planari artificiali e includono l’l-z-fosfatidylethanolamina (POPE) e 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), come descritto nella sezione del protocollo. Questo approccio può comportare un aumento del contenuto di colesterolo in >50% (vedere la sezione Risultati rappresentativi, Figura 2).
Un approccio alternativo all’arricchimento degli ovociti di Xenopus con dispersioni a base di fosofilidi comporta l’uso di ciclodextrin saturi di colesterolo, che è simile al modo in cui tessuti e cellule sono arricchiti. Tuttavia, abbiamo trovato questo approccio di bassa riproducibilità ed efficienza, con una media di 25% aumento del contenuto di colesterolo. Ciò è probabilmente dovuto alla diversa capacità di caricamento di questi due approcci (vedere la sezione Risultati rappresentativi, Figura 3). Al contrario, è stato dimostrato che l’utilizzo di ciclodextrinper per esaurire il colesterolo da Xenopus oocytes può provocare una diminuzione del colesterolo del 40% nel contenuto36.
Qui, ci concentriamo sull’arricchimento del colesterolo dei tessuti e delle cellule dei mammiferi attraverso l’applicazione di ciclodextrinsatura satura di colesterolo e di Enopus evociti usando i liposomi. Entrambi gli approcci possono essere sfruttati per delineare l’effetto dell’aumento dei livelli di colesterolo sulla funzione proteica. I meccanismi di modulazione del colesterolo della funzione proteica possono comportare interazioni dirette8 e/o effetti indiretti9. Quando il colesterolo influisce sulla funzione delle proteine tramite interazioni dirette, l’effetto di un aumento dei livelli di colesterolo sull’attività proteica è probabilmente indipendente dal tipo di cellula, dal sistema di espressione o dall’approccio di arricchimento. Per esempio, abbiamo utilizzato questi due approcci per determinare l’effetto del colesterolo sui canali di rettificazione interiore del potassio (GIRK) della proteina G e 32 espressi nei miociti atriale37,neuroni ippocampali32,38, HEK29339 cellule, e Xenopus oociti32,37. I risultati ottenuti in questi studi sono stati coerenti: in tutti e tre i tipi di cellule di mammiferi e negli ovociti anfibi il colesterolo ha aumentato la funzione del canale GIRK (vedi sezione Risultati rappresentativi, Figura 4, per i neuroni ippocampali e i corrispondenti esperimenti in ovociti di Xenopo). Inoltre, le osservazioni fatte in questi studi erano anche coerenti con i risultati degli studi condotti in miociti atriale37,40 e neuroni ippocampali32,38 appena isolati da animali sottoposti a una dieta ad alto colesterolo40. In particolare, l’arricchimento del colesterolo dei neuroni ippocampali utilizzando la funzione di abitarla ha invertito l’effetto della terapia dell’atorvastatina utilizzata per affrontare l’impatto della dieta ad alto colesterolo sia sui livelli di colesterolo che sulla funzione GIRK38. In altri studi, abbiamo studiato l’effetto delle mutazioni sulla sensibilità al colesterolo del canale di potassio rettificare interiormente Kir2.1 utilizzando sia gli evociti Xenopus che le cellule HEK29341. Ancora una volta, l’effetto delle mutazioni sulla sensibilità del canale era simile nei due sistemi.
Le applicazioni di entrambi i metodi di arricchimento per determinare l’impatto dei livelli elevati di colesterolo sulla funzione molecolare, cellulare, e dell’organo sono numerosi. In particolare, l’uso di complessi di colesterolo ciclodelo per arricchire le cellule e i tessuti è molto comune in gran parte a causa della sua specificità. Esempi recenti di questo approccio includono la determinazione dell’impatto del colesterolo sull’attivazione del canale HERG e i meccanismi sottostanti42, la scoperta che il colesterolo attiva il recettore accoppiato della proteina G levigato per promuovere la segnalazione delriccio 43, e l’identificazione del ruolo del colesterolo nella biomeccanica delle cellule staminali e nell’adipogenesi attraverso le proteine associate alla membrana44. Nel nostro lavoro, abbiamo utilizzato l’arricchimento dei tessuti mammiferi con il complesso M’CD:colesterolo per studiare l’effetto dell’arricchimento del colesterolo sulla funzione di base e il profilo farmacologico dei canali di calcio e tensione-gated di grandi conduttamenti (BK, MaxiK) nel muscolo liscio vascolare35,45,46. In altri studi, abbiamo usato l’approccio di dispersione basato sul fosfolipidi per arricchire gli evociti Xenopus con il colesterolo per determinare i ruoli delle diverse regioni nei canali Kir2.1 e GIRK nella sensibilità al colesterolo41,47,48,49, così come per determinare i siti di legame putativo in questi canali32,50,51.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi per arricchire i tessuti e le cellule dei mammiferi e gli evociti di Xenopus con il colesterolo costituiscono un potente strumento per studiare l’effetto dei livelli elevati di colesterolo sulle singole specie molecolari, sui complessi sistemi macromolecolari (ad esempio, proteine) e sulla funzione cellulare e dell’organo. In questo articolo, abbiamo descritto due approcci complementari che facilitano tali studi. In primo luogo, abbiamo descritto come arricchire i tessuti e le cellule con colesterolo ut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un borsedigio per lo sviluppo di scienziati (11SDG5190025) dell’American Heart Association (a A.R.-D.), e dal National Institute of Health R01 concede AA-023764 (a A.N.B.) e HL-104631 e R37 AA-11560 (a A.M.D.).
Materials
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Invitrogen | A12216 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set | Thermo Scientific | 23208 | |
| Brain PE 25Mg in Chloroform | Avanti Lipids | 840022C | |
| 16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform | Avanti Lipids | 840034C | |
| Cholesterol 100Mg Powder | Sigma | C8667 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | |
| HEPES | Corning | 61-034-RO | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285 | |
| MgSO4 | EMD Chemicals | MX0070-1 | |
| EDTA | VWR | E177 | |
| Dextrose Anhydrous | Fisher | BP350 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Blood Gas Tank | nexAir | ||
| NaOH | Fisher | S318 | |
| 1.5mL tubes | Fisher | S35818 | |
| Gastight Syringe 100uL | Hamilton | 1710 | |
| Microliter Syringe 25uL | Hamilton | 702 | |
| 12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube | Pyrex | 8120-12 | |
| Chloroform | Fisher | C298 | |
| Support Stand | Homescience Tools | CE-STAN5X8 | |
| Universal Clamp, 3-Prong | Homescience Tools | CE-CLPUNIV | |
| Sonicator | Laboratory Supplies | G112SP1G | |
| 3D rotator mixer | Benchmark Scientific | B3D 1308 | |
| 96 well plate | Sigma | BR781602 | |
| N2 gas | nexAir | ||
| Glass beakers 40ml-1L | Fisher | 02-540 | |
| Ice Machine | Scotsman | CU1526MA-1 | |
| Ice bucket | Fisher | 50-136-7764 | |
| 1X PBS | Corning | 21-031-CM | |
| TritonX | Fisher | BP151-100 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher | Model 100 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Amber bottles | Fisher | 03-251-420 | |
| Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets | FIsher | 13-678-4A | |
| Parafilm | FIsher | 50-998-944 | |
| Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator | FIsher | 97-990E | |
| Oocytes | Xenoocyte™ | 10005 | |
| Rat | Envigo | Sprague Dawley | weight 250g |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
| Water bath incubator with shaker | Precision | 51221080 | Lowest shaker setting O/N 37 °C |
| Filipin | Sigma | SAE0088-1ML | |
| DMSO | Fisher | BP231 | |
| Paraformaldehyde 4% | Mallinckrodt | 2621 | |
| DI H2O | University DI source | ||
| ProLong Gold antifade reagnet | Invitrogen | P10144 | |
| Microslides 75x25mm Frosted | Diagger | G15978A | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Microscope Coverslip | Diagger | G15972B | |
| Clear nail polish | Revlon | 771 Clear | |
| Labeling Tape | Fisher | 15-901-20F | |
| Securline Lab Marker II | Sigma | Z648205-5EA | |
| BD 10mL Syringe | Fisher | 14-823-16E | |
| 1.2 μm syringe filter | VWR | 28150-958 | |
| KimWipes | Fisher | 06-666A | |
| pH probe | Sartorus | py-p112s | |
| pH meter | Denver instrument | Model 225 | |
| 70% ETOH | Pharmco | 211USP/NF | |
| Timer | Fisher | 02-261-840 | |
| Steno book | Staples | 163485 |
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