JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Memeli Dokuları ve Kenopus Oositlerinin Kolesterol ile Zenginleşmesi

Published: March 25, 2020
doi:
10.3791/60734
, , , , ,
1Department of Pharmacology, Addiction Science and Toxicology,The University of Tennessee HSC, 2Department of Chemistry,University of Illinois at Chicago

Summary

Kolesterol zenginleştirme iki yöntem sunulmaktadır: siklodekstrin memeli doku ve hücreleri zenginleştirmek için kolesterol ile doymuş uygulanması, ve kolesterol zenginleştirilmiş fosfolipid tabanlı dağılımları kullanımı (lipozomlar) Xenopus oositleri zenginleştirmek için. Bu yöntemler moleküler, hücresel ve organ fonksiyonu nda yüksek kolesterol düzeylerinin etkisini belirlemek için etkilidir.

Abstract

Hücre fonksiyonlarını incelemek için kullanılan Xenopus oositleri de dahil olmak üzere memeli doku ve hücrelerinin kolesterol zenginleştirme, çeşitli yöntemler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada bu amaçla kullanılan iki önemli yaklaşımı açıklıyoruz. İlk olarak, serebral arterler (dokular) ve hipokampal nöronlar (hücreler) kullanarak kolesterol ile doymuş siklodekstrin kullanarak kolesterol ile doku ve hücreleri zenginleştirmek için nasıl örnek olarak açıklayın. Bu yaklaşım, doku, hücre veya hücre hatları her türlü için kullanılabilir. Kolesterol zenginleştirme için alternatif bir yaklaşım düşük yoğunluklu lipoprotein kullanımını içerir (LDL). Bu yaklaşımın avantajı hücrenin doğal kolesterol homeostaz makine nin bir kısmını kullanmasıdır. Ancak, siklodekstrin yaklaşımı kolesterol ile ilgi herhangi bir hücre tipi zenginleştirmek için uygulanabilir ise, LDL yaklaşımı LDL reseptörlerini ifade hücreleri ile sınırlıdır (örneğin, karaciğer hücreleri, kan lökositler ve doku makrofajları gibi kemik iliği kaynaklı hücreler), ve zenginleştirme düzeyi konsantrasyon ve LDL reseptörünün hareketliliğine bağlıdır. Ayrıca, LDL parçacıkları diğer lipidler içerir, bu nedenle kolesterol iletimi nonspesifiktir. İkinci olarak, xenopus oositleri kolesterol içeren fosfolipid bazlı dağılım (yani lipozomlar) kullanarak kolesterolle nasıl zenginleştirebileceğimizi açıklıyoruz. Kenopus oositler hücre ve protein fonksiyonlarını incelemek için kullanılan popüler bir heterolog ekspresyon sistemi oluşturur. Memeli dokusunun (serebral arterlerin) siklodekstrin bazlı kolesterol zenginleştirme yaklaşımı ve Xenopus oositlerinin fosfolipid bazlı kolesterol zenginleştirme yaklaşımı için kolesterol düzeylerinin 5 dk inkübasyondan sonra maksimuma ulaştığını göstermiş oluruz. Bu kolesterol seviyesi uzun kuluçka dönemlerinde sabit kalır (örn. 60 dk). Birlikte, bu veriler dokuların kolesterol zenginleştirme için optimize edilmiş zamansal koşulları için temel sağlamak, hücreler, ve fonksiyonel çalışmalar için Ksenin oositler kolesterol zenginleştirme etkisini sorgulamayı amaçlayan.

Introduction

Kolesterol, önemli bir hücresel lipid, çok sayıda kritik fonksiyonel ve yapısal roller oynar1,2,3,4,5,6,7,8,9. Plazma zarının fiziksel özelliklerini düzenlemekten hücre canlılığını, büyümesini, çoğalmasını sağlamaya ve biyokimyasal yolların bolbir çok suni ve öncü molekül olarak hizmet, kolesterol normal hücre ve organ fonksiyonu için gerekli bir zorunlu bileşenidir. Sonuç olarak, kolesterol eksikliği ciddi fiziksel malformasyonlar ve çeşitli bozukluklar ile sonuçlanır. Öte yandan, fizyolojik düzeyleri (2-3x) üzerinde kolesterol bile küçük bir artış sitotoksik1,2,10 ve kardiyovasküler 11 dahil bozuklukların gelişimi ile ilişkiliolmuştur,12,13 ve nörodejeneratif hastalıklar14,15,16,17.11 Böylece kolesterolün kritik fonksiyonlarını sorgulamak ve kolesterol düzeylerindeki değişikliklerin etkisini belirlemek için dokularda, hücrelerde ve Kenopus oositlerinde kolesterolün içeriğini değiştiren farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir.

Memeli doku ve hücrelerinde kolesterol düzeylerinin değiştirilmesi
Doku ve hücrelerde kolesterol düzeylerini azaltmak için çeşitli yaklaşımlar harnessed olabilir18. Bir yaklaşım kolesterol sentezi oranını kontrol HMG-CoA redüktaz inhibe etmek için lipoprotein eksikliği serum da çözünmüş statinler onların maruz içerir19,20. Ancak, Bu kolesterol düşürücü ilaçlar da mevalonat yolu boyunca non-sterol ürünlerin oluşumunu inhibe. Bu nedenle, mevalonat küçük bir miktar bu ürünlerin oluşumuna izin vermek için eklenir21 ve bu yaklaşımın özgüllüğünü artırmak. Kolesterol düzeylerini düşürmek için başka bir yaklaşım β-siklodekstrinkullanımı içerir. Bu glucopyranose monomerler steroller in boyutu eşleşen bir çapı ile bir iç hidrofobik kavite sahip22, hangi hücrelerden kolesterol çıkarılmasını kolaylaştırır, bu nedenle kendi yerli kolesterol içeriği onları tüketen23. 2-hidroksipropil-β-siklodekstrin (HPβCD), şu anda Niemann-Pick tip C hastalığının tedavisi için test edilen bir preklinik ilaç, lizozomal kolesterol depolama ile karakterize genetik olarak kalıtsal ölümcül metabolik bozukluk24. Kolesterol tükenmesi düzeyi kullanılan özel türev bağlıdır. Örneğin, HPβCD metillenmiş türev daha düşük kapasiteli kolesterol ayıklar, metil-β-siklodekstrin (MβCD)24,25,26,27,28,29,30. Özellikle, ancak, β-siklodekstrinler de kolesterol ek olarak diğer hidrofobik molekülleri ayıklayabilir, daha sonra nonspesifik etkilere neden olabilir31. Tükenmeaksine, hücreler ve dokular özellikle kolesterol ile presaturated olmuştur β-siklodekstrin ile tedavi yoluyla kolesterol ile zenginleştirilmiş olabilir23. Bu yaklaşım kolesterol tükenmesi için kullanılan β-siklodekstrinlerin özgüllüğü için bir kontrol olarak da kullanılabilir31. Doku ve hücrelerden kolesterol ün tükenir ve hücrelerin depolanmasında kullanılan ortamda çözünmüş 30-60 dk ila 5 mM MβCD hücreleri teşhir edilerek elde edilebilir. Bu yaklaşım kolesterol içeriğinde % 50 azalmaya neden olabilir (örneğin, hipokampal nöronlarda32, sıçan serebral arterler33). Diğer taraftan, doku ve hücrelerin kolesterol zenginleştirme için β-siklodekstrin-kolesterol kompleksi hazırlanması daha karmaşıktır ve protokol bölümünde açıklanacaktır.

Kolesterol ile doymuş β-siklodekstrin kullanarak doku ve hücrelerin zenginleşmesine alternatif bir yaklaşım ldl kullanımını içerir, dokularda ifade LDL reseptörleri dayanır18. Bu yaklaşım hücrenin doğal kolesterol homeostaz makine kullanarak avantajı sunarken, çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, LDL reseptörü ifade etmez dokular ve hücreler bu yaklaşım kullanılarak zenginleştirilmiş olamaz. İkincisi, LDL parçacıkları kolesterol ek olarak diğer lipidler içerir. Özellikle LDL, ApoB100 (%25) proteininden oluşur. ve aşağıdaki lipidler (%75): ~6-8% kolesterol, ~ 45-50% kolesteril ester, ~ 18-24% fosfolipidler, ve ~ 4-8% triacylglycerols34. Bu nedenle, LDL parçacıkları ile kolesterol teslim nonspesifiktir. Üçüncü olarak, LDL reseptörünü ifade eden doku ve hücrelerde LDL ile kolesterol içeriğindeki artış yüzdesi, kolesterole doymuş siklodekstrin kullanılarak gözlenen artıştan önemli ölçüde daha düşük olabilir. Örneğin, bir önceki çalışmada, LDL yoluyla kolesterol ile kemirgen serebral arterlerin zenginleşmesi kolesterol düzeylerisadece%10-15 artış ile sonuçlandı 35 . Buna karşılık, protokol bölümünde açıklandığı gibi siklodekstrin ile doymuş siklodekstrin ile bu arterlerin zenginleşmesi kolesterol içeriğinde >%50 artışa yol açmıştır (Bkz. Temsilsonuçları bölümü, Şekil 1).

Xenopus oositlerinde kolesterol düzeylerinin değiştirilmesi
Kenopus oositler genellikle hücre ve protein fonksiyonu nu incelemek için kullanılan heterolog bir ekspresyon sistemi oluşturur. Daha önceki çalışmalar, Kenopus oositlerinde fosfolipid molar oranına kolesterol oranının 0.5 ± 0.136olduğunu göstermiştir. Kolesterol bu içsel yüksek düzeyde nedeniyle, bu sistemde kolesterol içeriğini artırmak zordur, henüz membran fosfolipidler ve kolesterol yapılan dispersiyonlar kullanılarak elde edilebilir. Bu amaçla seçtiğimiz fosfolipidler, protokol bölümünde açıklandığı gibi yapay düzlemsel lipid çift katmanlı oluşturmak için kullanılanlara benzer ve l-α-fosfatidyletanolamine (PAPA) ve 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS) içerir. Bu yaklaşım kolesterol içeriğinde >%50 artışa neden olabilir (Bkz. Temsili Sonuçlar bölümü, Şekil 2).

Fosfolipid bazlı dağılımlar ile Xenopus oositleri zenginleştirmek için alternatif bir yaklaşım siklodekstrin kolesterol ile doymuş kullanımını içerir, dokular ve hücrelerin zenginleştirilmiş şekilde benzer. Ancak, biz kolesterol içeriğinde ~ 25% artış ortalama ile, düşük tekrarlanabilirlik ve verimlilik olarak bu yaklaşımı bulduk. Bunun nedeni muhtemelen bu iki yaklaşımın farklı yükleme kapasitesinden kaynaklanmaktadır (Bkz. Temsili Sonuçlar bölümü, Şekil 3). Buna karşılık, Xenopus oositler kolesterol tüketmek için siklodekstrin kullanarak kolesterol içeriğinde ~ 40% azalmaya neden olabilir gösterilmiştir36.

Burada, kolesterol ile doymuş siklodekstrin uygulaması ile memeli doku ve hücrelerinin kolesterol zenginleştirme odaklanmak, ve lipozomlar kullanarak Xenopus oositler. Her iki yaklaşım da artan kolesterol düzeylerinin protein fonksiyonu üzerindeki etkisini ifade etmek için kullanılabilir. Protein fonksiyonunun kolesterol modülasyonu mekanizmaları doğrudan etkileşimleri içerebilir8 ve/veya dolaylı etkiler9. Kolesterol doğrudan etkileşimler yoluyla protein fonksiyonunu etkilediğinde, kolesterol düzeylerindeki artışın protein aktivitesi üzerindeki etkisi büyük olasılıkla hücre tipinden, ekspresyon sisteminden veya zenginleştirme yaklaşımından bağımsızdır. Örneğin, atriyal miyosit37 , hipokampal nöronlar3232,38, HEK29339 hücreleri ve Xenopus oositler32,37ifade potasyum (GIRK) kanalları nda içe doğru doğru lanse g-protein üzerindeki kolesterol etkisini belirlemek için bu iki yaklaşım kullanılmıştır. Bu çalışmalarda elde edilen sonuçlar tutarlıydı: memeli hücrelerinin her üç türünde ve amfibi oositlerde kolesterol yukarı tgüllü GIRK kanal fonksiyonunda (Bkz. Temsili Sonuçlar bölümü, Şekil 4, hipokampal nöronlar ve Xenopus oositlerinde ilgili deneyler). Ayrıca, bu çalışmalarda yapılan gözlemler de atriyal miyositler 37yapılan çalışmaların sonuçları ile tutarlı idi37 ,40 ve hipokampal nöronlar32,38 taze yüksek kolesterol diyet tabi hayvanlardan izole40. Özellikle, MβCD kullanarak hipokampal nöronların kolesterol zenginleştirme kolesterol düzeyleri ve GIRK fonksiyonu hem yüksek kolesterol diyet etkisini ele almak için kullanılan atorvastatin tedavisinin etkisini tersine38. Diğer çalışmalarda, potasyum kanalı Kir2.1’in kolesterol duyarlılığı üzerindeki etkilerini hem Xenopus oositleri hem de HEK293 hücreleri41kullanarak araştırdık. Yine mutasyonların kanalın hassasiyeti üzerindeki etkisi iki sistemde de benzerdi.

Moleküler, hücresel ve organ fonksiyonu üzerinde yüksek kolesterol düzeylerinin etkisini belirlemek için her iki zenginleştirme yöntemlerinin uygulamaları çoktur. Özellikle siklodekstrin-kolesterol komplekslerinin hücre ve dokuları zenginleştirmek için kullanılması özgüllüğü nedeniyle çok yaygındır. Bu yaklaşımın son örnekleri HERG kanal aktivasyonu ve altta yatan mekanizmalar üzerinde kolesterol etkisinin belirlenmesi içerir42, kolesterol Kirpi sinyalizasyon teşvik etmek için düzeltilmiş G protein istemli reseptör aktive keşif43, ve membran ilişkili bağlayıcı proteinler aracılığıyla kolesterol rolünün belirlenmesi44. Kendi çalışmamızda, mβCD ile memeli doku zenginleştirme kullandı: kolesterol kompleksi temel fonksiyonu ve kalsiyum farmakolojik profili üzerindeki etkisini incelemek için- ve büyük iletkenlik voltaj kapılı kanalların (BK, MaxiK) vasküler düz kas35,45,46. Diğer çalışmalarda, biz kolesterol duyarlılığı41, 47, 48 , 49 farklı bölgelerin rollerini belirlemek için kolesterol ile Xenopus oositler zenginleştirmek için fosfolipid tabanlı dağılım yaklaşımı kullanılan 41,47,48,49, yanı sıra bu kanallarda putatif kolesterol bağlayıcı siteleri belirlemek için32,50,51.

Protocol

Hayvanlarla ilgili tüm deneysel işlemler Tennessee Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi’nde (UTHSC) gerçekleştirildi. Hayvanların bakımı ve deneysel protokoller, Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği tarafından akredite edilmiş bir kurum olan UTHSC Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. 1. Kolesterol ile doymuş metil-β-siklodekstrin kullanarak doku ve hücrelerin zenginleşmesi <p class="jov…

Representative Results

Siklodekstrin kullanımı kolesterol ile doku ve hücreleri zenginleştirmek için bir araç olarak kolesterol ile doymuş iyi kurulmuştur. Burada ilk olarak sıçan serebral arterlerini kolesterol ile zenginleştiren bu yaygın yaklaşımın mβCD ile kolesterol emaresini ortaya koymaktadır. Şekil 1A, görüntülenmiş serebral arter düz kas tabakasının bir örneğini gösterir ve doku zenginleştirmesiyle elde edilen ve 6,25 μM-6,25 …

Discussion

Memeli dokuları ve hücreleri ile Xenopus oositlerini kolesterolle zenginleştirme yöntemleri, yüksek kolesterol düzeylerinin bireysel moleküler türler, karmaşık makromoleküler sistemler (örneğin proteinler) ve hücresel ve organ fonksiyonu üzerindeki etkisini araştırmak için güçlü bir araçtır. Bu yazıda, bu tür çalışmaları kolaylaştıran iki tamamlayıcı yaklaşım tanımlanmıştır. İlk olarak, mβCD kolesterol ile doymuş kullanarak kolesterol ile doku ve hücreleri zenginleştir…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Amerikan Kalp Birliği’nden (A.R.-D.)’den (A.R.-D.)’ye ve National Institute of Health R01 tarafından (A.N.B.’ye) ve HL-104631 ve R37 AA-11560’a (A.M.D.’ye) bir Bilim Adamı Geliştirme Hibesi (11SDG5190025) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
  2. Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
  3. Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. 생화학. 36, 10959-10974 (1997).
  4. Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
  5. Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
  6. Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
  7. Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
  8. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. , 1135 (2019).
  9. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. , 1115 (2019).
  10. Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
  11. Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
  12. Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
  13. Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
  14. Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration?. Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
  15. Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer’s disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
  16. Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage?. Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
  17. Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
  18. Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
  19. Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
  20. Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
  21. Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
  22. López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020 (2011).
  23. Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
  24. Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
  25. Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054 (2010).
  26. Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
  27. Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
  28. Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
  29. Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
  30. Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
  31. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
  32. Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
  33. Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
  34. Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
  35. Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
  36. Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
  37. Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
  38. Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
  39. Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
  40. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A., Kumar, S. A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. , 95-119 (2015).
  41. Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
  42. Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
  43. Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304 (2016).
  44. Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. , (2019).
  45. North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
  46. Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
  47. Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
  48. Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
  49. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
  50. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
  51. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
  52. Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
  53. Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
  54. Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).

Tags

Cholesterol EnrichmentXenopus OocytesHypercholesterolemiaCellular MembranesCerebral ArteriesCircle Of WillisMethyl-beta-cyclodextrinCholesterol Saturated SolutionLipid HandlingFilipin Staining
check_url/kr/60734?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image