Summary

إنشاء أنظمه تحديد البروتين المستحثة كيميائيا للغاية بواسطة الاختيار المتدرج لمكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية

Published: January 14, 2020
doi:

Summary

إنشاء أنظمه البروتين المستحث كيميائيا مع التقارب والخصوصية المطلوبة لأي من الجزيئات الصغيرة المعطية والتي تحتوي علي العديد من تطبيقات الاستشعار البيولوجي والتفعيل. هنا ، نقوم بوصف طريقه فعاله وقابله للتعميم للهندسة الهندسية للانظمه المستحثة كيميائيا عن طريق الاختيار المتدرج لمكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية المعروضة.

Abstract

الاحداث البروتينية البروتين التي تحدث فقط في وجود الاربطه جزيء صغير وتمكين تطوير الجزيئات الصغيرة الحيوية لتشريح والتلاعب في المسارات البيولوجية. حاليا ، لا يوجد سوي عدد محدود من النظم المستحثة كيميائيا (CID) والهندسة الجديدة مع الحساسية المطلوبة والانتقائية ل يغاندس الجزيئات الصغيرة المحددة لا تزال تشكل تحديا في مجال هندسه البروتين. نقدم هنا وصفا لطريقه الفحص العالية الانتاجيه ، وهي انتخابات المباحث الجنائية التي تجريها شركه دي نوفو للهندسة من أجل الانظمه الجنائية المطبقة علي مجموعه كبيره ومتنوعة من الليغانز. يستخدم هذا الأسلوب الاختيار من خطوتين من مكتبه nanobody التوافقية المعروضة phage للحصول علي 1) “الموثقات مرساه” التي ربط أولا إلى يجند الفائدة ثم 2) “الموثقات ديميريشن” التي تربط فقط لمرساه الموثق-يجند المجمعات. لتحديد الموثقات مرساه ، يتم فحص مكتبه التوافقية من أكثر من 109 التكامل تحديد المنطقة (CDR)-العشوائية nanobodies مع liginylated ويتم التحقق من الإصابات مع الاربطه غير المسمية بواسطة قياس التداخل الطبقة الحيوية (BLI). للحصول علي المجلدات التعريفية ، يتم فحص مكتبه nanobody مع الموثق مرساه-ligand المجمعات كاهداف للفحص الإيجابي والموثقات مرساه غير منضم للفحص السلبي. الجمع بين-CID ينطبق علي نطاق واسع لتحديد المجلدات CID مع الغلوبولين المناعي الأخرى ، غير الغلوبولين المناعي ، أو السقالات مصممه حسابيا لخلق الاستشعار البيولوجي لفي المختبر والجسم الحيوي الكشف عن المخدرات ، والأيض ، والجزيئات الإشارات ، الخ.

Introduction

نظم CID ، التي اثنين من البروتينات dimerize فقط في وجود الحرف جزيء صغير (الشكل 1) ، وتقدم أدوات متعددة لتشريح والتلاعب الأيض ، والإشارات ، وغيرها من المسارات البيولوجية1. وقد أظهرت القدرات في التشغيل البيولوجي, مثل المخدرات التي تسيطر عليها التنشيط الخلية t2 والمبرمج3,4, لتحسين سلامه وفعالية العلاج الخلوي t التبني. الاضافه إلى ذلك ، فانها توفر منهجيه جديده للكشف عن أهداف الجزيئات الصغيرة في الجسم المجري أو في المختبر. علي سبيل المثال ، يمكن ان تكون البروتينات CID تنصهر وراثيا مع نظم مراسل مضان (علي سبيل المثال ، نقل الطاقة بالرنين الفلوري (الحنق)5 والبروتينات الفلورية المشعة دائري)6 للوقت الحقيقي في القياسات المجرية ، أو بمثابه الكواشف التقارب لانزيم المناعي المرتبطة مقايسة (اليسا)-مثل

وعلي الرغم من تطبيقاتها الواسعة ، فان إنشاء أنظمه جديده للتحكم الجنائي يمكن التحكم فيها بواسطة الجزيئات الصغيرة المعطية والتي تواجه تحديات كبيره. إنشاء البروتين الموثق الأساليب الهندسية بما في ذلك التطعيم الحيواني7، في اختيار المختبر8،9، والحاسوبية تصميم البروتين10 يمكن ان تولد البروتينات الربط التي تعمل عن طريق ثنائي البروتين-يجند التفاعلات. ومع ذلك ، فان هذه الطرق لديها صعوبات في إنشاء مجمع CID الثلاثي المستحث. بعض الطرق إنشاء CID عن طريق ربط كيميائيا اثنين من يغاندس التي ترتبط بشكل مستقل إلى نفس أو مختلف البروتينات11,12,13,14,15,16 أو الاعتماد علي اختيار البروتينات الموثق مثل الأجسام المضادة التي تستهدف الموجودة مسبقا جزيء البروتين المجمعات17,18, التالي يكون خيارا محدودا من li

وقد قمنا مؤخرا بوضع الانتخاباتالخاصة بالإجراءات الجنائية الخاصة بأسلوب “الجمع بين المباحث الجنائيةمن أجل الهندسة الهندسية لأنظمه المباحث الجنائية19. يمكن لهذه الطريقة الحصول علي خصوصية عاليه من الربط المستحث بالضغط (علي سبيل المثال ، ثابت الانفصال الموثق مرساه ، كد (بدون Ligand)/كد (مع ligand) > 1,000). يتم تحقيق الخصوصية باستخدام المجلدات مرساه مع مواقع ملزمه مرنه التي يمكن ان تدخل تغييرات المطابقة علي الربط ، وتوفير أساس لاختيار الموثقات انتقائية المطابقة فقط الاعتراف الموثقات مرساه الربط. لقد أظهرنا دليلا علي المبدا من خلال خلق الاختلافات الناجمة عن الكانبديه (CBD) من نانوبوديس ، وهو جزء من 12 إلى 15 من الأجسام المضادة الوظيفية من الكامريد التي تتالف من سقالة عالميه وثلاث حلقات مرنهلل CDR(الشكل 2)20، والتييمكن ان تشكل جيب ملزم مع احجام قابله للتكيف وعلي وجه الخصوص ، فان اختيار مكتبه البروتين التوافقي في المختبر ينبغي ان يكون فعالا من حيث التكلفة وقابلا للتعميم بالنسبة لهندسه CID لان نفس المكتبة ذات الجودة العالية يمكن تطبيقها علي العديد من الligands.

في هذا البروتوكول والفيديو ، ونحن نركز علي وصف الاختيار من خطوتين في المختبر والتحقق من مرساه (الشكل 3ا) والمجلدات ديميريشن (الشكل 3ب) عن طريق فحص مكتبه nanobody التوافقية مع تنوع اعلي من 109 باستخدام اتفاقيه التنوع البيولوجي كهدف ، ولكن ينبغي ان ينطبق البروتوكول علي مكتبات البروتين وعاده ما يستغرق فحص المجلدات الخاصة بالمباحث الجنائية ما بين 6 و 10 أسابيع (الشكل 4).

Protocol

1-بناء المكتبات استخدام مكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية الاصطناعية مع تنوع من ~ 1.23 – 7-14 x 109، كما هو موضح سابقا19. علي الرغم من ان هذا البروتوكول لا يتضمن إنشاء المكتبة ، الا انه يمكن تطبيقه علي مكتبات موثقه أخرى للدمج. 2-التعكر الحيوي لل…

Representative Results

ونحن نوضح الاختيار من خطوتين في المختبر والتحقق من الموثقات مرساه والتهجين من خلال فحص مكتبه nanobody التوافقية مع تنوع اعلي من 109 باستخدام اتفاقيه التنوع البيولوجي كهدف. ومن المهم تقييم إثراء القرصنة البيولوجية خلال الجولات المتعاقبة من الاختيار لكل من المرساة والمجلدات الثنائية. نتا…

Discussion

ومن المهم لاختيار التركيزات الصحيحة من المكتبات بالعاثيه الإدخال لجولات مختلفه من القرصنة البيولوجية. بدانا عاده من مكتبه المدخلات من ~ 1012-1013 الجسيمات بالعاثيه مع التنوع > 109، والسماح ~ 100-1000 نسخه من كل استنساخ بالعاثيه ليتم تقديمها في السحب إلى أسفل المقايسة. إذا كان التر?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزه جامعه واشنطن للابتكار (إلى L.G.) ، وهي منحه من المعاهد الوطنية الامريكيه للصحة (1R35GM128918 إلى L.G.) ، وصندوق لبدء التشغيل من جامعه واشنطن (إلى L.G.). وقد تم دعم اتش جي) من قبل الزمالة الجامعية لمؤسسه واشنطن للأبحاث. وقد تم دعم K.W. من قبل زمالة جامعيه من معهد جامعه واشنطن لتصميم البروتين.

Materials

1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution Thermo Fisher Scientific 34029
Agar Thermo Fisher Scientific BP1423-2
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) Millipore UFC900324
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Casein Sigma-Aldrich C7078-1KG
CM13 Helper phage Antibody Design Labs PH020L
D-(+)-Glucose monohydrate Alfa Aesar A11090
Dynabeads M-280 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 11205D
DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
EDTA Thermo Fisher Scientific BP120-1
Fast DNA Ladder New England Biolabs N3238S
FastDigest BglI Thermo Fisher Scientific FD0074
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335
HiPrep 26/10 Desalting Column GE Healthcare 17508701
HisTrap-FF-1ml GE Healthcare 11000458
Imidazole Alfa Aesar 161-0718
IPTG Thermo Fisher Scientific 34060
Kanamycin Thermo Fisher Scientific BP906-5
M13 Major Coat Protein Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53004
NaCl Sigma-Aldrich S3014-500G
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates Thermo Fisher Scientific 260251
Nunc MaxiSorp Thermo Fisher Scientific 44-2404-21
Octet RED96 ForteBio N/A
pADL-23c Phagemid Vector Antibody Design Labs PD0111
PEG-6000 Sigma-Aldrich 81260-1KG
Platinum SuperFi DNA Polymerase Invitrogen 12351010
PureLink PCR Purification Kit Thermo Fisher Scientific K310001
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 27704
Recovery Medium Lucigen 80026-1
SpectraMax Plus 384 Molecular Devices N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG
Super Streptavidin (SSA) Biosensors ForteBio 18-5057
Superdex 75 increase 10/300 GL Column GE Healthcare 28-9909-44
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific 15224-025
TG1 Electrocompetent Cells Lucigen 60502-1
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283-100mL
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Thermo Fisher Scientific BP9726-5
Tween 20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Yeast Extract Thermo Fisher Scientific BP1422-2
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89882

References

  1. Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
  2. Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), (2015).
  3. Straathof, K. C., et al. An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).
  4. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).
  5. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  6. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  7. Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin. Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).
  8. Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).
  9. Chen, G., et al. Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS). Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).
  10. Tinberg, C. E., et al. Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity. Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).
  11. Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).
  12. Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation. Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).
  13. Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).
  14. Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  15. Erhart, D., et al. Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers. Chemistry & Biology. 20 (4), 549-557 (2013).
  16. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).
  17. Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications. Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).
  18. Foight, G. W., et al. Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses. Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).
  19. Kang, S., et al. COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems. Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).
  20. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  21. Fanning, S. W., Horn, J. R. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).
  22. Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies. Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).
  23. Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. . The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).
  24. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  25. Gu, L., et al. Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins. Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).

Play Video

Cite This Article
Gomez-Castillo, L., Watanabe, K., Jiang, H., Kang, S., Gu, L. Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library. J. Vis. Exp. (155), e60738, doi:10.3791/60738 (2020).

View Video